细胞凋亡的流式细胞术检测.ppt

细胞凋亡与细胞坏死 1 细胞凋亡的流式检测方法 2 流式检测细胞凋亡面临的问题 3 目 录 1.1 细胞凋亡细胞凋亡 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样，是机体生存和发育离不开的最基本生物现象，通过凋亡可以平衡机体内细胞的数目，清除衰老、过剩、有害的细胞。与细胞凋亡有关的疾病与细胞凋亡有关的疾病 细胞凋亡的形态特征细胞凋亡的形态特征 凋亡的起始：微绒毛消失，细胞间接触消失，与周围细胞脱离，细胞质中线粒体大体完整，染色质固缩；细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围；凋亡小体 逐渐被 周围专 职或非 专职吞 噬细胞 吞噬。是细胞受到严重损伤或大剂量细胞毒药物作用后出现的反应。早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。继而溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症。1.2 细胞坏死细胞坏死 细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别 坏死 凋亡 1.性质 2.诱导因素 强烈刺激，随机发生 较弱刺激，非随机发生 3.生化特点 4.形态变化 6.DNA电泳 5.炎症反应 7.凋亡小体 8.基因调控 被动过程，无新蛋白合成，不耗能 主动过程，有新蛋白合成，耗能 细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀 胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩 弥散性降解，电泳呈均一DNA片状 DNA片段化（180-200bp），电泳呈“梯”状条带 溶酶体破裂，局部炎症反应 溶酶体相对完整，局部无炎症反应 有 病理性，非特异性 生理性或病理性，特异性 无 有 无 2 细胞凋亡的流式检测方法细胞凋亡的流式检测方法 利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变小，SSC增大 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀，FSC、SSC变大，胞膜破裂，胞内含物释出后FSC、SSC均变小。2.1 PI单染检测 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测 2.3 细胞内钙离子测定 2.4 线粒体膜电位检测 2.5 Caspases细胞酶的检测 2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU 2.7 凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53 2 细胞凋亡的流式检测方法细胞凋亡的流式检测方法 与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来同时判定细胞周期和凋亡。凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方图中G0/G1峰前可出现亚二倍体峰，即凋亡峰 通过峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所占的比率。2.1 PI单染检测单染检测 PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的 同时可以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较 该法简便、标本制备容易、检测费用低 缺点：PI单染色法无法确认来自哪一时相的凋亡，对于S 期和G2/M 期的细胞发生凋亡时，凋亡峰有时与G1 峰或S 峰相互重叠，导致G1 峰或S 峰增宽而无典型的sub-G1 峰出现，所以无法分析来自S 期或G2/M 期细胞的凋亡，应借助其他方法进行检测 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测双染检测 Annexin V选择性结合PS。用带有荧光标记的Annexin V，就可以用流式细胞仪非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。PI(7-AAD)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。此法简单、可靠，由于凋亡时细胞膜的改变大大早于DNA 的改变，因此Annexin V/PI(或7-AAD)双染色是检测早期凋亡细胞的敏感方法。由于该法必须用活细胞，因此检测时间受到限制，且对凋亡晚期细胞和坏死细胞无法准确区分。Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。Fluo-4 将Fluo-3结构中的Cl替换成F，荧光强度比Fluo-3强1倍 Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。2.3 细胞内钙离子测定细胞内钙离子测定 JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)m 的理想荧光探针。线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光正常细胞 线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光凋亡细胞 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。2.4 线粒体膜电位检测线粒体膜电位检测 喜树碱(CPT)诱导HL-60细胞凋亡，3小时后用JC-1检测线粒体膜电位的改变。可见，凋亡细胞红色荧光降低。caspases家族在凋亡过程中起到非常重要的作用，其中caspases-3 是最重要的指示蛋白酶。研究结果表明，caspases-3 可在凋亡发生的早期被激活，激活的caspases-3 继而使其他caspases 裂 解并被激活，同时还可激活细胞质和细胞核中的相关成分。caspases-3 的活性只有在凋亡的早期才能检测到，随后在凋亡的过程中持续升高，在凋亡的晚期快速下降。对caspases-3 的连续监测，可动态观察凋亡的整个过程。2.5 Caspases细胞酶的检测细胞酶的检测 该法简单、快速，但不适于常规多功能流式细胞仪(不具备紫外光源)的检测。主要有Caspases-3流式细胞检测试剂盒，Caspases-2/Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗体 2.6 DNA 碎片分析：碎片分析：Apo-BrdU 核酸内切酶活化使核小体内DNA断裂为50300kb片段，裂解为200bp DNA碎片，暴露出多个3羟基末端。利用外源性TdT使外源性dUTP或 BrdUTP 连接到DNA 碎片的3羟基末端。以荧光标记抗dUTP或抗BrdUTP抗体检测dUTP或BrdUTP数量，从而间 接检测凋亡 加PI 染色，在定量检测凋亡细胞同时显示凋亡细胞在细胞周期中所位置 在此法中，细胞固定先用甲醛，再用乙醇 因为在凋亡细胞中可以检测出两群DNA：一群是低分子量的DNA(100200bp)，弥散分布在凋亡细胞 另一群是高分子量的DNA 或仍然黏附在核基质上的DNA，乙醇固定后冲洗不能将其从细胞中洗去。用树碱(CPT)诱导HL-60细胞凋亡，0、120和150分钟时用TUNEL(BrdUTP)/PI双染法检测DNA断裂，同时分析细胞周期。可见凋亡随着诱导时间的增加而增多，且可知凋亡发生的时相。此方法灵敏度高、特异性好，目前己被广泛采用。由于DNA 断裂发生在细胞凋亡的早期阶段，先于其形态 学上的改变，可用于早期凋亡的研究。通过与PI 双染色，克服了PI 单染色法的缺点，可以鉴定 细胞凋亡发生在细胞周期的具体时相。2.7 凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53的检测的检测 在细胞凋亡的研究中，要重视对凋亡相关蛋白的检测，它们在特定的信号传导通路中与启动凋亡的信号分子相互作用。从凋亡的开始到凋亡的结束，许多信号传导通路都需要或受到特定的蛋白间相互作用的调控。凋亡相关蛋白：主要有Apo-1(Fas)、FasL的相关抗体，Bcl-2相关检测抗体、p53等调控凋亡的基因蛋白产物 注意事项注意事项 有些蛋白存在于细胞膜表面，如Fas；有些则存在于胞质或细胞核内，如p53、bc1-2 标本的处理方法不同 破膜是关键，最佳的破膜既能使膜通透性增强，又能保持膜的完整性，使膜表面的抗原分子不被破坏。皂角素(saponin)是目前最佳的破膜剂，它优于乙醇、甲醇和甲醛等。3.细胞凋亡检测面临的问题细胞凋亡检测面临的问题 3.1 凋亡假阳性产生原因：凋亡假阳性产生原因：PS外翻使凋亡细胞和凋亡小体容易被邻近细胞所吸附并被吞噬 吞噬细胞 并非仅为专职的吞噬细胞(如单核和粒细胞)，成纤维细胞或上皮细胞也具吞噬作用。尤其是实体瘤，常可见在凋亡细胞周围的肿瘤和非肿瘤细胞中有含有凋亡小体的吞噬体。邻近细胞吞噬凋亡细胞后的残留物中即包含了变化的细胞膜、断裂DNA等凋亡特征物。即使很轻微处理（胰酶消化/机械振荡/细胞刮取等）均会造成PS 的外翻。3.2 区分凋亡区分凋亡、坏死和凋亡的坏死和凋亡的“坏死期坏死期”：产生原因产生原因：晚期凋亡与坏死相似 细胞膜破裂，用PI排染和AnnexinV结合实验无法区分。胰酶消化时间过长、机械损伤(如细胞刮取、肿瘤细胞分 离或反复离心等)、电穿孔或某些药物处理时，细胞膜的 通透性和对称性均会改变。解决方法：解决方法：形态学特征是区分凋亡和坏死的“金标准”。3.3 样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失：样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失：贴壁培养细胞的分离 凋亡早期，细胞即脱离培养瓶表面并悬浮在培养液中。因此去除培养液，然后加胰酶或EDTA消化的方法不可避免的会失去很多凋亡细胞。-将培养液和消化下来的细胞合在一起将培养液和消化下来的细胞合在一起 胰酶消化本身就倾向于破坏细胞膜已破损的晚期凋亡和坏死细胞，导致 丢失。密度梯度离心 密度梯度离心选择性丢失即将死亡和死亡细胞，因凋亡早期细胞脱水，核和胞浆皱缩，其密度高于非凋亡的细胞。反复离心和机械振荡 离心时，某些细胞可静电吸附在管壁上。如白细胞中的单核 和粒细胞在反复离心时丢失，而淋巴细胞仍留在悬液中。-加入过量的载体细胞，如鸡红细胞等加入过量的载体细胞，如鸡红细胞等 凋亡细胞，尤其是晚期凋亡细胞很脆弱，在反复离心或振荡时易碎。-加入血清或白蛋白、缩短离心时间、降低离心转速加入血清或白蛋白、缩短离心时间、降低离心转速