细胞内细胞因子染色法07.ppt

细胞内细胞因子染色法细胞内细胞因子染色法 中山医学院免疫学教研室 实验原理 细胞因子跨膜分泌阻滞剂细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFABFA，使新产生，使新产生细胞因子滞留在细胞内；细胞因子滞留在细胞内；破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内，并破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内，并可以检测相应细胞因子；可以检测相应细胞因子；流式细胞记数技术可以记数细胞，分析流式细胞记数技术可以记数细胞，分析相应细胞的质和量。相应细胞的质和量。方法特点方法特点 1.1.单细胞水平计数单细胞水平计数 2.2.简单、快捷、灵敏简单、快捷、灵敏 3.3.实验结果客观实验结果客观 实验过程实验过程 取淋巴细胞取淋巴细胞，刺激剂作用刺激剂作用，37孵育孵育1小时小时 加入加入BFA继续培养继续培养5小时小时，用用PBS洗涤洗涤。4%多聚甲醛室温固定多聚甲醛室温固定8分钟后分钟后，PBS洗涤洗涤。重悬细胞重悬细胞，4放置几小时或过夜放置几小时或过夜。加入荧光标记抗体加入荧光标记抗体,4避光避光30分钟分钟，洗涤洗涤。缓冲液缓冲液2重悬重悬，流式细胞记数仪检测流式细胞记数仪检测。结果分析结果分析 需要的缓冲液 1.1PBS 1升升（洗细胞用洗细胞用）2.PBS+0.1%BSA+NaN3 0.05%500ml(用于用于染色后染色后FACS前前)3.PBS+BSA+NaN3+0.1%Saponin 250ml(封封闭染色后用闭染色后用)4.PBS+BSA+NaN3+Saponin+5%milk 40ml 流式细胞仪流式细胞仪（FLOW CYTOMETER，FCM）对于处在流动状态的细胞或生物颗粒进行多参数的快速的定量和分析的技术。检测仪器检测仪器：流流 式式 细细 胞胞 记记 数数 仪仪 FCM结构组成部分 液流系统液流系统;将细胞引导至检测位点将细胞引导至检测位点 光学系统光学系统;产生并收集光学信号产生并收集光学信号 电子系统电子系统;将光信号转换成电信号将光信号转换成电信号,使之数字化使之数字化,输入计算机并分输入计算机并分析。析。细胞分选系统。细胞分选系统。FLOW CELL(流动室流动室)Injector Tip 荧光信号 聚焦的激光光束 鞘液鞘液 荧光信号荧光信号 每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号 荧光染料的特性荧光染料的特性 激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)激发光源与荧光标记物激发光源与荧光标记物 FALS Sensor Laser 前向角散射光信号前向角散射光信号 FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向角散射光信号侧向角散射光信号 FreqFluorescence FALS Sensor Fluorescence detector(FL1,FL2,FL3,FL4)检测信号检测信号 双参数点图双参数点图 标本制备标本制备 标本来源:外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤)制成单细胞悬液 标本浓度：10106 6/ml/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标外周血白细胞计数，白血病人血标本需本需PBSPBS稀释稀释 抗凝剂：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检测。溶血剂：保持细胞形态、红细胞裂解完全。反应温度：2627 C C，室温避光。，室温避光。结结 果果 示示 范范 1.56 0.25 8.23 0.26 左图显示在抗原刺激前，左图显示在抗原刺激前，CD4+和和CD4-细胞中能产生细胞中能产生IFN-的细胞占的细胞占PBMC的的0.25%和和1.56%右图显示在抗原刺激后，右图显示在抗原刺激后，CD4-细胞中能产生细胞中能产生IFN-的增加到的增加到8.23%，提示该，提示该抗原能促进抗原能促进CD4-细胞分泌细胞分泌IFN-