流式细胞术在科研中的应用描述.ppt

流式细胞术在科研中 的应用 什么是流式细胞仪 流式细胞仪实物 BD FACSVantage BD-Calibur 流式细胞仪可检测到的细胞参数 非荧光信号非荧光信号 颗粒度颗粒度 细胞大小细胞大小=前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性相对复杂性 外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图 荧光信号荧光信号 荧光强度（荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）高高FL细胞与低细胞与低FL细胞区分开来（强弱）细胞区分开来（强弱）一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出），可测出三个三个FL，即，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（或三个激光光源（488nm、633nm和和325nm），可测出），可测出6个个FL。荧光信号荧光信号 双色直接染色双色直接染色 流式报告的图一般分为四种流式报告的图一般分为四种，即散点图即散点图、直方直方图图、密度图和二维等高图等密度图和二维等高图等。最常用的为散点最常用的为散点图和直方图图和直方图。几个概念：几个概念：%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。阳性细胞的数量。Mean：平均荧光强度，与被检测物质的表达平均荧光强度，与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。量有关，在正态分布时一般用该值。Geo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。为偏态分布时一般用该值。散点图 密度图 二维等高图 直方图 图 报告中常见的几种流式细胞图 R1File:4Acquisition Date:06-Mar-03QuadEvents%Gated X MeanY MeanUL2542.4037.47461.36UR106710.08816.86468.89LL529149.9819.574.41LR397537.55418.809.87图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死 流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析 点图分析点图分析 流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析 直方图分析直方图分析 图中100101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞 当前流式细胞分析发展趋势当前流式细胞分析发展趋势 从相对细胞计数到绝对细胞计数从相对细胞计数到绝对细胞计数 从相对定量到绝对定量分析从相对定量到绝对定量分析 从单色到多色荧光分析从单色到多色荧光分析 从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞膜成分到细胞内成分分析 从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析析 今天主要内容：流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用 流式细胞术在肿瘤细胞DNA倍体中的应用 流式细胞仪的分选功能 流式细胞术在蛋白检测中的应用 细胞凋亡检测细胞凋亡检测 1、半胱氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期）检测法（早早期）2、Annexin V-FITC/PI 法（早期）法（早期）3、Apo2.7检测法（早期）检测法（早期）4、TUNEL 法（晚期）法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）含量分析法（晚晚期）6、细胞凋亡相关蛋白的流式细胞术检测、细胞凋亡相关蛋白的流式细胞术检测 流式细胞术检测细胞凋亡流式细胞术检测细胞凋亡 细胞凋亡的分析细胞凋亡的分析 细胞凋亡的主要表现细胞凋亡的主要表现 细胞内水解酶改变：如细胞内水解酶改变：如Caspase-3活化活化 细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI 细胞核细胞核DNA的断裂改变：的断裂改变：TUNNEL实验实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白：Fas Bcl-2 细胞凋亡细胞凋亡Active Caspases-3 细胞凋亡细胞凋亡Caspases-3 细胞凋亡细胞凋亡Annexin 凋亡检测（凋亡检测（Annexin V/PIAnnexin V/PI法）法）PI Annexin VAnnexin V-FITCFITC DNA倍体的流式分析 细胞细胞DNA含量检测含量检测 细胞固定后用细胞固定后用PI（Propidium iodide碘化丙啶），碘化丙啶），染色，因为染色，因为PI特异性结合于细胞特异性结合于细胞DNA，荧光强度，荧光强度与与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。体以及凋亡的检测。单参数直方图 图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图 DNA细胞周期分析细胞周期分析 细胞周期细胞周期 G2 M G0 G1 s 200 400 600 800 1000 G0 G1 s G2 M DNA分析分析 DNA含量含量 细细胞胞数数量量 2N 4N 2倍体倍体 异倍体异倍体 4倍体倍体 肿瘤组织中的各种肿瘤组织中的各种DNA倍体倍体 含量与凋亡关系含量与凋亡关系 DNA亚亚G1峰的检测：利用峰的检测：利用PI染色，检测具有染色，检测具有亚亚G1期期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的的DNA片段从细胞内流出，造成总体片段从细胞内流出，造成总体DNA含含量减少，成为亚量减少，成为亚2倍体。倍体。Date acquired:14-Jan-03 File:7Gy 4hr.001 Source:dongbo DIPLOID:100.00%Dip G0-G1:73.12%at 48.16 Dip G2-M:9.59%at 96.33 Dip S:17.29%G2/G1:2.00 Dip%CV:6.04 Apoptosis:13.66%Mean:27.48 R1图图 FCM测试细胞周测试细胞周 期分布和凋亡期分布和凋亡 流式细胞仪的细胞分选功能 分选：分选：用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般分选速度为每秒钟一般分选速度为每秒钟300300个细胞，个细胞，大型机分选速度可达到每秒上万个细胞大型机分选速度可达到每秒上万个细胞 488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell Sorting Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 流式分选与分子生物学研究流式分选与分子生物学研究 除了将分选得到的细胞进行后续培养除了将分选得到的细胞进行后续培养研究外，研究外，FCMFCM分选系统可为分选系统可为PCRPCR、FISHFISH等分子技术提供纯度较高的特异性细等分子技术提供纯度较高的特异性细胞群，减少研究中的干扰因素，获得胞群，减少研究中的干扰因素，获得更准确的实验结果。更准确的实验结果。Cytometric Beads Array(CBA)流式液相多重蛋流式液相多重蛋白白 定量技术定量技术 导言导言 常规的蛋白分析方法：常规的蛋白分析方法：ELISA：一次反应只能检测一个指标：一次反应只能检测一个指标 Western blot：不能对蛋白精确定量：不能对蛋白精确定量 不足之处：不足之处：检测多个指标需耗费大量样本检测多个指标需耗费大量样本 分批操作导致组间差异大分批操作导致组间差异大 操作繁琐，耗时耗力操作繁琐，耗时耗力 如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得高精确度的数据呢？以定量，获得高精确度的数据呢？针对于此，针对于此，BD-Pharmingen成功研发了基于流式细胞仪检成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术测平台的液相多重蛋白定量技术BD Cytometric Bead Array，简称，简称CBA CBACBA技术简介技术简介 CBA是一系列带有不同强度红色荧光是一系列带有不同强度红色荧光、包被有捕获抗体包被有捕获抗体的微球的微球，类似类似ELISA的捕获孔板的捕获孔板，可以捕获液相样本可以捕获液相样本（血清血清、血浆或者细胞培养上清液等血浆或者细胞培养上清液等）中相应的抗原中相应的抗原，再结合再结合PE标记检测抗体标记检测抗体，形成双抗体夹心结构形成双抗体夹心结构，通过通过流式细胞仪进行荧光检测流式细胞仪进行荧光检测，便可同时对样本中的多种可便可同时对样本中的多种可溶性蛋白成分进行定量溶性蛋白成分进行定量 +Analyte of interest Fluorescent detection Ab capture Bead capture Ab Bead BD Cytometric Bead Array 1 2 3 不同强度红色荧光不同强度红色荧光的捕获微球，在的捕获微球，在FCM FL3检测检测 不同的目标蛋白不同的目标蛋白 PE 标记的检测抗体，标记的检测抗体，在在FCM FL2检测。检测。PE的荧光强度即反映的荧光强度即反映靶蛋白的含量靶蛋白的含量 4 5 6 Human Th1/Th2 Lymphokine CBA Th1/Th2 panel:IL2,IL4,IL5,IL10,TNF,IFN 用 FL3荧光的强度不同区别 种不同的微球（beads）Direct sandwich immunoassay FL2(PE)detector reagent 样本处理 6 cytokines from a 50 L sample Three pipetting steps 3 hour total incubation Quantitative results and complete report generation Software assisted quantitative analysis,with curve fitting algorithm Result reporting included in software Human Th1/Th2 Lymphokine CBA Chemokine-I CBA Assay Standard 0 pg/ml CBA Assay Standard 10 pg/ml CBA Assay Standard cont.cont.Chemokine-I CBA Assay Standard 20 pg/ml CBA Assay Standard cont.cont.Chemokine-I CBA Assay Standard 40 pg/ml CBA Assay Standard cont.cont.Chemokine-I CBA Assay Standard 80 pg/ml CBA Assay Standard cont.cont.Chemokine-I CBA Assay Standard 156 p