流式细胞仪原理及应用(HIV).ppt

碧迪医疗器械（上海）有限公司碧迪医疗器械（上海）有限公司 上海市上海市静静安嘉里中心安嘉里中心3座座10楼楼 李苏辉李苏辉 流式细胞仪流式细胞仪 原理及仪器维护保养原理及仪器维护保养 白细胞的组成白细胞的组成 白细胞的组成及其分化抗原白细胞的组成及其分化抗原 白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志。消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志。1986年世界卫生组织命年世界卫生组织命名委员会建议应用名委员会建议应用CD系列来统一命名白细胞分化抗原系列来统一命名白细胞分化抗原 白细胞（CD45)淋巴细胞 单核细胞(CD14/15)粒细胞(CD15)B cell（CD19等）NK cell（CD16/56)T cell(CD3)嗜酸性粒细胞 嗜碱性粒细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 Th cell(CD4)Tc cell(CD8)SHA-LFR032-20080930-4N 13E for Jerel 细胞毒性细胞毒性T淋巴细胞淋巴细胞;分泌穿孔素、分泌穿孔素、IFN、TNF等。特点：等。特点：MHC-1类分子限制、类分子限制、直接接触、反复杀伤直接接触、反复杀伤 自然杀伤细胞（自然杀伤细胞（NK)：抗体依赖细胞：抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、淋巴因子介导细介导的细胞毒作用、淋巴因子介导细胞毒作用、胞毒作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 补体系统的活化（经典、凝集素、补体系统的活化（经典、凝集素、替代途径）。作用（溶胞作用、吞替代途径）。作用（溶胞作用、吞噬条理作用、趋化性、噬条理作用、趋化性、炎症反应炎症反应等）等）中和抗原：形成免疫复合物，被吞噬中和抗原：形成免疫复合物，被吞噬细胞清除（条理作用）、毒素中和作细胞清除（条理作用）、毒素中和作用、感染中和作用用、感染中和作用 体液免疫和细胞免疫的作用体液免疫和细胞免疫的作用 淋巴因子依赖的细胞毒作用淋巴因子依赖的细胞毒作用 免疫应答的过程及免疫应答的过程及Th细胞的作用细胞的作用 免疫应答：细胞免疫 体液免疫 Th细胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可诱导 Th、Tc分裂增值；Th2分泌IL-4、IL-5,可使B细胞活化，产生抗体 B细胞完全活化需要Th帮助 流式细胞仪原理流式细胞仪原理 流式细胞术流式细胞术(Flow cytometry)对于处在流动状态的细胞或生物颗粒对于处在流动状态的细胞或生物颗粒同时进行多参数的快速的分析和定量同时进行多参数的快速的分析和定量的技术的技术 T T C H CD3 CD3 CD8 CD4 流式细胞仪检测原理及在T细胞分析中应用 Analyze Incubate 激发光源与荧光标记物激发光源与荧光标记物 FACSCaliburFACSCalibur流式细胞仪仪器结构流式细胞仪仪器结构 液流系统液流系统 光学系统光学系统 激光光源激光光源 光收集系统光收集系统 电子系统电子系统 光电转换光电转换 数据处理系统数据处理系统 软件系统软件系统 液流系统液流系统-鞘液鞘液 流式细胞仪原理流式细胞仪原理 Injector Tip 荧光信号及前向角、侧向角散射光 聚焦的激光光束 鞘液鞘液 光学系统光学系统 激光(Laser,light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的光照 激光波长:488nm,635nm 检测信号检测信号 散射光信号散射光信号 FSC:FSC:前向角散射光前向角散射光 SSC:SSC:侧向角散射光侧向角散射光(90(90度散射光度散射光)荧光信号荧光信号 荧光染料荧光染料 光学滤片光学滤片 检测信号检测信号 FALS Sensor Laser 前向角散射光信号前向角散射光信号 前向角散射光信号前向角散射光信号 散射光信号前向角散射光信号(FSC)FSCFSC-F Forwardorward (A Angelngel L Light)ight)S Scattercatter 在激光束正前方的检测器在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测为前向散射光检测器器 FSCFSC的强度与细胞或其他颗粒的大小的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及形状及 optical homogeneity optical homogeneity 有关有关 FSCFSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如如:大小大小 FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向角散射光信号侧向角散射光信号 侧向角散射光信号侧向角散射光信号 侧向角散射光信号侧向角散射光信号(SSC)SSC-Side(Angel Light)Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也也称为称为9090度散射光检测器度散射光检测器 SSCSSC的强度与细胞或其他颗粒的大小的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及形状及 optical homogeneity optical homogeneity 有关有关 SSCSSC用于检测细胞内部结构用于检测细胞内部结构 如如:胞浆内颗粒多少胞浆内颗粒多少,核质比核质比 流式细胞仪的检测信号：散射光流式细胞仪的检测信号：散射光 FSC，前向角散射光，前向角散射光，代表细胞大小代表细胞大小 SSC，侧向角散射光，侧向角散射光，代表细胞粒度代表细胞粒度 Right Angle Light Detector Cell Complexity SSC Forward Light Detector Cell Surface Area FSC Incident Light Source 荧光信号荧光信号 每种荧光染料均有特定的激发波长每种荧光染料均有特定的激发波长,并并激发后会有发射波长激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测检测)这些光学信号这些光学信号 光学系统光学系统 FCMFCM的光学系统是由若干组透镜的光学系统是由若干组透镜,滤波滤波片片,小孔组成小孔组成 光路光路 -滤片特性滤片特性 长通滤片长通滤片 允许长于设定波长的光通允许长于设定波长的光通过过 短通滤片短通滤片 允许短于设定波长的光通允许短于设定波长的光通过过 带通滤片带通滤片 允许一定带宽的波长通过允许一定带宽的波长通过 460 500 540 460 500 540 460 500 540 SP 500 LP 500 BP500/50 长通 短通 带通 光学滤片光学滤片 荧光信号荧光信号 荧光信号荧光信号 光路光路 -滤片特性滤片特性 当以当以 4545o o 角角放置长通滤片时放置长通滤片时,该滤片可以通该滤片可以通过一定波长的光过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波同时也可以阻断并折射该波长以下的光长以下的光 这种方式的滤片称为二向色性长通滤片这种方式的滤片称为二向色性长通滤片(dichroic filter)光学系统光学系统 电子系统电子系统 当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时,受激激发,产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号,这些信号经A/D转换成数字信号,送计算机进行储存、作图、统计分析 发射波长发射波长 Wavelength(nm)400 450 500 550 600 650 700 1000 800 600 400 200 0 PE FITC PerCP 750 流式细胞仪原理流式细胞仪原理 荧光信号荧光信号 650nm 700nm FL3 650 and Above 500nm 600nm FL1 530/30 FL2 585/42 Relative Intensity FITC PE PerCP Wavelength(nm)550nm 检测器检测器 Photomultiplier tube(PMT)将光学信号转变为电脉冲将光学信号转变为电脉冲(数字数据数字数据)信号信号 单平台绝对计数单平台绝对计数 管中预先加有准确定量的管中预先加有准确定量的Beads 流式细胞仪获取数据后，由各目标群的含量，流式细胞仪获取数据后，由各目标群的含量，可以计算出相对含量可以计算出相对含量%由各目标群与由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量胞群的绝对含量 计算公式：计算公式：细胞获取数细胞获取数 Beads总量总量 细胞细胞/L=Beads获取数获取数 样本量样本量 注：注：Beads总量见总量见TruCOUNT管外包装管外包装 MultiSET系统中，样本量为系统中，样本量为50 L 单平台绝对计数单平台绝对计数 使用使用TriTEST或或MultiTEST试剂，在试剂，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴细胞绝对计数管中完成全血的淋巴细胞绝对计数 TruCOUNT管中预先加有准确定量的管中预先加有准确定量的Beads，每批每批TruCOUNT管的管的Beads含量一致含量一致 由各目标群与由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量胞群的绝对含量 使用直接荧光标记抗体组合，一步处理外周血使用直接荧光标记抗体组合，一步处理外周血 使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本 操作简便，省时省力，计数结果重复性好操作简便，省时省力，计数结果重复性好 淋巴细胞分析淋巴细胞分析 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析亚群区分开，进行定量分析 淋巴细胞分析淋巴细胞分析 TriTEST：三色试剂：三色试剂CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45 MultiTEST：四色试剂：四色试剂CD3/CD8/CD45/CD4 TruCOUNT：单平台绝对计数管：单平台绝对计数管 报告报告Th,Ts,Th/Ts 百分含量百分含量%与绝对含量与绝对含量cells/uL TriTEST CD4/CD8/CD3 T Lymph Events CD3+CD4+%T Lymph CD3+CD8+%T Lymph CD3+CD4+CD8+%T Lymph T H/S Ratio Bead Events CD3+Abs Cnt CD3+CD4+Abs Cnt CD3+CD8+Abs Cnt CD3+CD4+CD8+Abs Cnt 淋巴细胞四色分析淋巴细胞四色分析 Lymph Abs Cnt CD3+%Lymph CD3+Abs Cnt CD3+CD4+%Lymph CD3+CD4+Abs Cnt CD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+Abs Cnt CD3+CD4+CD8+%Lymph CD3+CD4+CD8+Abs Cnt T H/S Ratio MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4 MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19 FacsCalibur仪器样本操作仪器样本操作 仪器校正：加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样。仪器校正：加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样。样本操作：溶血、有凝块的血不要做样本操作：溶血、有凝块的血不要做 加样前，抗凝血颠倒混匀加样前，抗凝血颠倒混匀810次（避免混匀器混匀）次（避免混匀器混匀）使用反向加样法，枪头贴壁。加样枪在试管内不要放松使用反向加样法，枪头贴壁。加样枪在试管内不要放松 FACSComp没有通过怎么办？没有通过怎么办？FSC或SSC没有通过：原因：1.由于仪器的管路没有清洗干净 2.使用的鞘液杂质太多(换鞘液）BD公司专用鞘液 3.校准品失效 4.仪器故障 措施：1.