流式细胞仪分析技术应用.ppt

实验室流式细胞仪单细胞分选技术 流式细胞术流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。选的新技术。流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量 流式细胞术的特点流式细胞术的特点 （1 1）液流系统液流系统 （2 2）光学系统光学系统 （3 3）数据处理系统数据处理系统 1.流式细胞仪的基本结构：流式细胞仪的基本结构：通过流式细胞仪进行细胞分选通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。进一步培养和研究时进行的。细胞分选原理细胞分选原理 细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱 流动室振动流动室振动 液流断裂成液滴液流断裂成液滴 空白液滴空白液滴 含细胞的液滴含细胞的液滴 弃去弃去 偏转落入收集器偏转落入收集器 压电晶体压电晶体 产生产生机械振动机械振动 不充电不充电 充电充电（一）分选基本原理（一）分选基本原理 分选速度：分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。的百分率。分选收获率：分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。与分选速度成反比。（二）分选的技术要求（二）分选的技术要求 参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL 数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双、双参数散点图参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维、假三维等高图等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）设门分析技术设门分析技术 第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析 FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小 SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度 FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少 一、一、参数参数 单参数直方图单参数直方图 双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图 三参数直方图三参数直方图 多参数分析多参数分析 直分析方图直分析方图 设门分析设门分析:REGION和和GATE设置设置 二、数据显示方式二、数据显示方式 由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图（一）单参数直方图 单参数直方图单参数直方图 细胞相对数量细胞相对数量 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。（二）双参数直方图（二）双参数直方图 1.双参数直方图点图双参数直方图点图 绿色荧光强度绿色荧光强度 红色荧光强度红色荧光强度 2.二维等高图二维等高图 由类似地图上的等高线组成，其本质也是由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即胞相对或绝对数，即“等高等高”。曲线层次越高曲线层次越高(越里面的线越里面的线)所代表的细胞所代表的细胞数愈多。数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。二维等高图二维等高图 3.假三维等高图假三维等高图（三）三参数直方图（三）三参数直方图 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数分析（四）流式细胞仪的多参数分析 GateGate设置：指在某一张选定参数的直设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。形门、多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术三、设门分析技术 A A 淋巴细胞淋巴细胞 B B 单核细胞单核细胞 C C 中性粒细胞中性粒细胞 A A、B B、C C均均为任意门为任意门 线性门线性门 样本制备样本制备 标记染色标记染色 液相芯片技术液相芯片技术 质量控制质量控制 第四节第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 外周血淋巴细胞样品的制备外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞分离单个核细胞 培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞脱落使贴壁细胞脱落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤 单细胞悬液单细胞悬液 一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备 新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法机械法 酶处理法酶处理法 化学试剂处理法化学试剂处理法 表面活性剂处理法表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年）深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周）甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）1 Phosphate Buffer Saline or HBSS(Ca/Mg+free)1 mM EDTA 25 mM HEPES pH 7.0 1%Fetal Bovine Serum(Heat-inactivated)Sorting Buffer 淋巴淋巴细胞细胞：1x HBSS(with Ca+/Mg+)含含1%FBS HBSS配方中的配方中的阳离子阳离子可可增加细胞增加细胞的生存力。的生存力。由由于这些细胞并非易于聚集于这些细胞并非易于聚集，即便配方中沒有，即便配方中沒有EDTA也不也不会会造成造成问题问题。较黏着较黏着的的细胞细胞(sticky cells)：提高提高EDTA 到到 5mM 并并使用透析使用透析过过的的FBS(against Ca+/Mg+free PBS)。某些。某些细胞细胞在活在活化化会比较会比较黏著而黏著而EDTA可抑制此作用可抑制此作用 贴壁贴壁型型细胞细胞株株(Adherent cells)：以以Trypsin处理后处理后去去准备单细胞悬液时准备单细胞悬液时，待，待细胞变圆细胞变圆(切记切记不可不可过度过度作用作用)，便以，便以5 ml 含含5%血清血清培养液培养液收取收取细胞细胞，并均匀并均匀地打散地打散细胞悬液细胞悬液。离心后离心后，用，用sorting buffer调整调整细胞浓度细胞浓度。如果需要的。如果需要的话，话，可以提高可以提高EDTA的的浓度浓度(至至5mM)以避免細胞重新黏聚。以避免細胞重新黏聚。含有高比例死細胞的含有高比例死細胞的样本样本：Sorting buffer加加5mM MgCl2以及以及2550 g/mL DNAase I(Sigma D-4513)或是或是Sorting buffer加加0.83mM MgCl2以及以及20 U DNAase II(Sigma D-4138)。这些这些配方配方可減少因死可減少因死细胞释放细胞释放出來的出來的DNA所造成的所造成的细胞细胞黏聚黏聚现象现象。尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素 PE-Cy5/APC&PerCP-Cy5.5/APC 为弱表达的抗原选择较亮的荧光素为弱表达的抗原选择较亮的荧光素 CD62L on CD8+T 防止耦联染料降解（光照防止耦联染料降解（光照/固定固定/升温等）造成的干扰升温等）造成的干扰 APC-Cy7/PE-Cy7 二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记染色 尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素 Minimize the potential for spectral overlap Spillover estimates available in the spectra viewer 2 FITCFITC Texas redTexas red PE.PC.APCPE.PC.APC PEcy5PEcy5 FL1 FL2 FL3 FL4 激光激光 细细胞胞悬悬液液 异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 得州红得州红 能量传递复合染料能量传递复合染料 藻胆蛋白类藻胆蛋白类 （一）几种常见的荧光染料（一）几种常见的荧光染料 名称名称 染料染料 激发激发波长波长 荧光颜荧光颜色色 溶解性溶解性 对对PHPH敏感敏感性性 特点特点 异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素 FITCFITC 488488 绿绿 525525 易易 敏感敏感 易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性 得州红得州红 Texas Texas redred 568568 红红 615615 不易不易 不敏感不敏感 稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低 藻红蛋白藻红蛋白 PEPE 488488 橙橙 575575 易易 不敏感不敏感 具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高 藻青蛋白藻青蛋白 PCPC 488488 别藻青蛋白别藻青蛋白 APCAPC 633633 红红 670670 能量传递复能量传递复合染料合染料 PEcy5PEcy5 488488 红红 670670 易易 不敏感不敏感 减少交叉，成本高减少交叉，成本高 常用的几类荧光染料常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在结合在一起，在488nm488nm激发光照射下，通过激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。测到该特定荧光信号。能量传递复合染料能量传递复合染料 PE CY5 CY5 CY5 488nm 575nm 670nm 红色荧光 花青苷花青苷5 5 藻红蛋白藻红蛋白 能量传递复合染料机制能量传递复合染料机制 多色分析时组合抗体的使用原则 在免疫表型分析中，常常把多种荧光素标记抗体同时组合在一起进行多色分析，但并非多种抗体均可以自由组合在一起使用。在多数荧光素标记抗体组合应用之前，必须将每种抗体单独应用和组合应