流式细胞仪(2014年).ppt

罗敏 流式细胞仪 1 流 式 细 胞 仪 流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是以激光为光源、检测生物学颗粒理化性质的仪器。生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、染色体、蛋白质、脂质体、细胞器、病毒颗粒、细菌、真菌、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等。理化性质包括细胞大小、细胞形状、细胞膜完整性、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白含量、酶活性等。罗敏 流式细胞仪 2 流 式 细 胞 仪-流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry，FCM）流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析技术。同时依赖测量到的参数还可以用物理的方法将一个群体中的细胞亚群分选出来，即流式细胞分选术（cell sorting）。流式细胞术综合应用了激光技术、流体力学、细胞生物化学技术、荧光标记技术、单克隆抗体技术、分子生物学技术、计算机技术及临床医学等多门技术。罗敏 流式细胞仪 3 流 式 细 胞 仪-发展历史 流式细胞仪的发展历史 1934年，Moldavan使悬浮的红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来。这就是流式细胞仪的雏形。1965年，Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色细胞，给出细胞中核酸的含量和细胞大小。奠定了多参数流式细胞测量的基础。罗敏 流式细胞仪 4 流 式 细 胞 仪-发展历史 1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了层流流动室和氩激光器，开发出了液流束、照明光轴、检测系统三者相互垂直的流式细胞仪。这成为目前各种流式细胞仪的基础。1969年，Fulwyler利用静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。罗敏 流式细胞仪 5 流 式 细 胞 仪-发展历史 20世纪70年代，随着Kohler和Milstein成功提出了单克隆抗体技术和荧光标记技术，为特异研究和分析细胞奠定了良好的基础。1973年，美国BD公司和美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界上第一台商用流式细胞仪FACS I。罗敏 流式细胞仪 6 流 式 细 胞 仪-发展历史 20世纪80年代，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单位进入医院的中心实验室和检验科，成为现代化的临床检验仪器的一部分。罗敏 流式细胞仪 7 流 式 细 胞 仪-发展历史 目前，流式细胞仪同时朝着更加专业化和更加普及化的两个不同的方向发展。更加专业化是指仪器更精密、更灵敏地进行更多参数的分析和更快、更纯地进行细胞分选。更加普及化是指仪器更易于使用，使之成为实验室里更常用的仪器。罗敏 流式细胞仪 8 流式细胞仪-特点 FCM与其他细胞分析技术相比，有如下特点：高速度：每秒可检测1 0005 000个细胞。高灵敏度：每个细胞只要带有1 0003 000个荧光分子就能检出，两个细胞之间有5%的差别就可区分出来，光散射的灵敏度为0.3um。高精度：在细胞悬液中测量细胞，比其他分析技术的变异系数更小，分辨率高。高纯度：分选细胞的纯度可大于99%以上。多参数：可同时定量检测单个细胞的DNA等多个参数。在适当的条件，可对活细胞进行无害性分析和分选。罗敏 流式细胞仪 9 流式细胞仪-分类 流式细胞仪的分类 根据功能不同，可分为临床型和综合型（科研型）。根据有无细胞分选功能，可分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。根据结构不同，可分为一般流式细胞仪（零分辨率流式细胞仪）和狭缝扫描流式细胞仪（高分辨率流式细胞仪）。前者的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑，直径在35um。罗敏 流式细胞仪 10 流 式 细 胞 仪-学习内容 流式细胞仪的基本原理 流式细胞仪的基本结构 流式细胞仪的性能指标 流式细胞仪的使用 流式细胞仪的应用 流式细胞仪实例 罗敏 流式细胞仪 11 I 流式细胞仪的基本原理 基本原理：将悬浮分散的单细胞悬液，经特异性荧光染料染色 后，放入样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，流动室充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱，液柱与水平方向的入射激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被成90角方向放置的光电倍增荧光检测器和前向角放置的光电二极管检测器接收，经过转换器转换为电子信号。电子信号经模/数转换输入计算机。计算机通过相应的软件储存、计算、分析，就可以得到细胞的大小和活性、核酸含量等理化指标。示意图 罗敏 流式细胞仪 12 I 流式细胞仪的基本原理 细胞分选原理：在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使之产生同频率的机械振动，流动室也随之振动，这样通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。在细胞形成液滴以前，各类细胞的特性已在测量区被测定并储存。如果其特性与要分选的细胞相同时，仪器就在这类细胞形成液滴时给该液滴充与指定的电荷，这样，当被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，未被选定的细胞形成的细胞液滴及不含细胞的空白液滴不被充电，也就不带电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依据所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，不带电荷的液滴不发生偏转，垂直落入废液槽中排出，从而实现细胞的分类。罗敏 流式细胞仪 13 I 流式细胞仪的基本原理 荧光染色原理 免疫荧光染色：细胞膜上或细胞内的抗原分子与相应的荧光素标记McAb作用一定时间后形成带有荧光素的抗原抗体复合物，经激光激发后发出特定的荧光，其荧光强度与被测定抗原分子含量呈比例关系，由此可求得被测细胞与标记McAb相对应抗原的表达量和阳性细胞百分比。常用的荧光染料有异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、别藻青蛋白（APC）和Perdinin叶绿素（PerCP）等，经488nm激光激发后其发射荧光光谱有差别，因而可将其用于标记不同的McAb进行单色或多色免疫荧光染色。目前，流式细胞术有单色、双色、三色、四色、五色荧光分析，对细胞的分析更加精密、深入。罗敏 流式细胞仪 14 I 流式细胞仪的基本原理 免疫荧光染色常用方法：直接免疫荧光法：用一种（单色）或者多种（多色）荧光素标记的McAb染色细胞后测量其荧光强度和阳性细胞数。间接免疫荧光法：用一种McAb与细胞作用后，洗去未结合McAb，再加入荧光素标记的第二抗体（如羊抗鼠IgG-FITC），染色细胞后测量其荧光强度及阳性细胞数。罗敏 流式细胞仪 15 I 流式细胞仪的基本原理 荧光染色原理 普通荧光染色：用荧光染料直接染细胞中相应的成分。如核酸染色。核酸染色：多种荧光染料如碘化丙啶（PI）、赫斯特（hoechst，HO）、色霉素A3（CA3）等可与DNA分子结合，其中以PI最常用。PI可选择性地嵌入DNA分子双螺旋的碱基之间，经激光激发后发出橙红色荧光，其荧光强度与细胞DNA分子含量成比例关系，可用于DNA倍体及细胞周期分析。罗敏 流式细胞仪 16 I 流式细胞仪的基本原理 单色直接免疫荧光染色 罗敏 流式细胞仪 17 I 流式细胞仪的基本原理 单色直接免疫荧光染色：异硫氰酸荧光素（FITC）分子标记McAb直接荧光染色后，荧光显微镜下可见发射绿色荧光的阳性细胞。罗敏 流式细胞仪 18 I 流式细胞仪的基本原理 双色直接免疫荧光染色 罗敏 流式细胞仪 19 I 流式细胞仪的基本原理 双色直接免疫荧光染色：异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）两种荧光素分子标记的McAb直接荧光染色后，荧光显微镜下可见绿色荧光（FITC）、橙红色荧光（PE）和黄绿色荧光（FITC和PE双染色）的三种阳性细胞。罗敏 流式细胞仪 20 I 流式细胞仪的基本原理 三色直接免疫荧光染色 罗敏 流式细胞仪 21 I 流式细胞仪的基本原理 三色直接免疫荧光染色：用异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、别藻蓝蛋白（APC）三种荧光素标记的McAb直接荧光染色后，荧光显微镜下可见绿色（FITC）、橙色（PE）、红色（APC）和两种或三种染色混合的阳性细胞。罗敏 流式细胞仪 22 I 流式细胞仪的基本原理 核酸染色：细胞经透膜处理后，PI分子与细胞核中的DNA结合，在荧光显微镜下可见呈红色荧光的细胞核。罗敏 流式细胞仪 23 I 流式细胞仪的基本原理+-+-+-样品液 鞘液 前向角散射光检测器 90角荧光检测器 氩激光光源 流动室 喷嘴 测量区 +偏转板 样品管 收集器 图：工 作 原 理 示 意 图 罗敏 流式细胞仪 24 I I 流式细胞仪的基本结构 流式细胞仪基本结构包括五部分：（）光源 （）液流系统 （）信号接收系统 （）信号处理系统 （）细胞分选器 以上整个系统由电子电路和计算机控制，用以收集、显示、分析、储存被测定的各种信号及控制细胞的分选收集。罗敏 流式细胞仪 25 I I 流式细胞仪的基本结构 光 源 液 流 系 统 信 号 接 收 信 号 处 理 细胞分选 图：流式细胞仪构成示意图 罗敏 流式细胞仪 26 I I 流式细胞仪的基本结构（1）光源 流式细胞仪中使用的光源多为氩离子激光器。氩离子激光器是一种气体激光器，通过气体放电使氩离子电离并激发，实现粒子数反转而产生激光，谱线有十余条，其中绿光514nm和蓝光488nm两条谱线最强。选择哪条谱线作为激发光源，主要是依据荧光染料的激发光谱而定，越接近被其激发光谱的峰值，所产生的荧光信号越强。罗敏 流式细胞仪 27 I I 流式细胞仪的基本结构（1）激光（Laser）光源 激光的特性 良好的单色性 单向性 发散角小 罗敏 流式细胞仪 28 I I 流式细胞仪的基本结构（）液流系统 液流系统是样品和鞘液（生理盐水或磷酸盐缓冲液）进入、流动、排出的通道。由氮气加压系统、鞘流瓶、样品管、流动室、喷嘴等组成。在高压氮的压力下，样品液进入样品管，在流动室与鞘液相混，以样品流居中、鞘液流包绕的流束形式到达经特殊设计的喷嘴，并以稳流的形式喷出，在喷嘴附近的测量区被测量后，形成液滴，进入分选器，未被分选的细胞和鞘液排入废液槽。罗敏 流式细胞仪 29 I I 流式细胞仪的基本结构（）激光束 荧光检测器 散射光检测器 1号鞘液 样品管 2号鞘液 图：内检式流动室示意图 罗敏 流式细胞仪 30 I I 流式细胞仪的基本结构（）激光束 荧光检测器 散射光检测器 鞘液 图：在空气中检测流动室示意图 样品管 样品液 罗敏 流式细胞仪 31 I I 流式细胞仪的基本结构（）荧光显微镜 环状结构 鞘液 图：显微检测流动室示意图 样品管 样品液 罗敏 流式细胞仪 32 I I 流式细胞仪的基本结构（）图：四种典型流动室示意图（）（1）（2）罗敏 流式细胞仪 33 I I 流式细胞仪的基本结构（）图：四种典型流动室示意图（2）（3）（4）罗敏 流式细胞仪 34 I I 流式细胞仪的基本结构（）FACS Calibur 流式细胞仪的样品流动 罗敏 流式细胞仪 35 I I 流式细胞仪的基本结构（）信号接收系统 流式细胞仪主要接收细胞的散射光信号和荧光信号，并将其转换为与散射光和荧光强度成正比的电压脉冲。罗敏 流式细胞仪 36 I I 流式细胞仪的基本结构（）细胞通过测量区时信号的产生 罗敏 流式细胞仪 37 I I 流式细胞仪的基本结构（）细胞通过测量区时信号的产生：电压脉冲的形成 罗敏 流式细胞仪 38 I I 流式细胞仪的基本结构（）散射光信号 细胞在通过激光测量区时，在空间360立体角的所用方向散射光线，散射光信号与细胞大小、形状、质膜及细胞内部的折射率有关。在流式细胞仪中，通常在前向角和侧向角接收和检测细胞散射光，