抗体融合蛋白.ppt

抗体融合蛋白 目录 抗体融合蛋白的定义 抗肿瘤抗体药物的发展趋势 VEGF-EGFR 多靶向 Fc 融合蛋白 EVP1 的构建及其结合特性 抗体融合蛋白 将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到多样性生物功能的融合蛋白如：1.含Fv段的抗体融合蛋白：将Fv与某些毒素、酶、细胞因子基因拼连，通过这些抗体的引导，可将其生物活性物质导向靶细胞特定部位，所谓“生物导弹”。2.嵌合受体：将ScFv与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白，可表达于细胞表面，称为嵌合受体，由于其介导的杀伤效应不受MHC限制，在过继性免疫治疗中有潜在应用价值。3.含Fc的抗体融合蛋白：CD4分子细胞膜外部分与Fc融合后由真核细胞表达。此融合蛋白能竞争结合HIV，阻断HIV对敏感细胞的感染；还可介导ADCC及CDC，可通过胎盘。抗体药物 抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物。其具有特异性高、性质均一及针对特定靶点定向制备等优点。抗体药物主要用于恶性肿瘤、免疫性疾病、移植排斥反应、感染性疾病和心血管疾病等的治疗，特别是其对肿瘤治疗的应用前景备受关注。抗肿瘤抗体药物的分类 按抗肿瘤抗体药物结构可将其分为 4 类 1.抗体，也称裸抗体。根据其人源化的程度，又可分为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体。2.抗体片段，包括 Fab、单链抗体、双链抗体、三链抗体、微型抗体等。3.抗体偶联物，由抗体或抗体片段与“弹头”药物连接而成。可用作“弹头”的物质有放射性核素、化学治疗(化疗)药物和毒素。这些“弹头”物质与抗体连接，分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。4.抗体融合蛋白，由抗体片段和活性蛋白两部分构成。抗肿瘤抗体药物的特点 抗体药物有以下几个特点 1.具有高亲和性和特异性，使得抗体药物高效特异性地发挥靶向治疗作用。2.半衰期短，平均为 1021 d，从而减少了使用次数，易被患者接受。3.多样性，主要表现为靶抗原的多样性，抗体结构(抗原互补决定区氨基酸序列变化)的多样性和作用机制的多样性以及“弹头”化合物的多样性。4.制备抗肿瘤抗体药物的定靶性；即根据需要利用基因工程技术制备具有不同治疗作用的抗体药物。可以针对特定的靶分子，定向制备相应的抗体；也可以根据需要选择相应的“弹头”药物或效应分子，制备相应的免疫偶联物或融合蛋白。抗肿瘤抗体药物的发展趋势 抗肿瘤抗体药物由单一靶点到多靶点方向发展 抗肿瘤抗体药物的高效小型化 抗体组学和抗体组药物的兴起 近年来单克隆抗体 单抗 药物发展迅猛，仅2010 年全球就有 30 余个单抗药物经批准上市销售，已产生500 亿美元以上的年销售额。然而，对于复杂的恶性肿瘤，其病因复杂，细胞内信号通路冗余或交叉，单一靶点的治疗适用性窄且易产生耐药性，因而多靶向药物已成为抗体领域的重要发展方向。现在应用较多的已上市的单克隆抗体药物，有针对肿瘤细胞增殖信号转导通路的利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉非替尼、厄洛替尼、伊马替尼、埃克替尼和西妥昔单抗，以及针对肿瘤新血管生成的贝伐珠单抗等一大批分子靶向药物 这些抗肿瘤抗体药物都是针对单一的靶点，但是肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过程，从单一靶点对肿瘤治疗是远不够的。从 2005 年以来临床研究证实，索拉非尼等多靶点药物 可使晚期肾癌 患者的无进展生存期延长一倍。阻断其他通路的药物，如注射用的mTOR 抑制药替西罗莫司和口服的 mTOR 抑制药依维莫司，相继在 2007年和 2010 年也获 FDA 批准上市。非小细胞肺癌的靶向治疗除了吉非替尼 和厄洛替尼等单靶点药物以外，凡德他尼和索拉非尼也在进行临床试验，初步结果令人鼓舞。2009 与 2011 年，生物制药巨头 Genentech 公司基于“two-in-one”策略，相继开发了同时靶向 VEGF 与 HER2，以及同时靶向 EGFR 与 HER3 的双特异性抗体，疗效明显优于针对单个靶标的单抗治疗，在国际上引起强烈反响 双特异性抗体 抗体两个结合点表现为不同的特异性，即分别结合不同表位。如，一个结合靶细胞（如肿瘤细胞），另一结合药物或免疫效应细胞（如蓖麻毒素、抗癌药物、细胞毒性细胞）双特异性抗体双特异性抗体 左明辉等于 2012 年研制出种同时结合 VEGF，EGFR，HER2 的 Fc 融合蛋白EVP1，是一种富有潜力的多靶向抗体类治疗肿瘤药物。VEGF-EGFR 多靶向 Fc 融合蛋白 EVP1 的构建 方法：1.利用 PCR 方法扩增 Herin 基因和 Flt-1 基因 Ig 样第二结构域 FLt-1D2 编码序列，全序列合成带有点突变的 Human IgG1 的 Fc 段编码序列，利用重组 PCR 方法将 Herin、Flt-1D2和 Fc 基因依次连接，构成 Herin-Flt-1D2-Fc 基因 命名为 EVP1 基因。2.再将 EVP1 编码基因插入质粒 pDC659，构建携带 EVP1基因的腺病毒穿梭质粒 pDC659-EVP1。3.将质粒 pDC659-EVP1 与腺病毒骨架载体 pPE3-F35 共转染至 293 细胞，包装获得表达EVP1 融合蛋白的非增殖型腺病毒 Ad5/35-EVP1，经 PCR 鉴定，扩增、纯化病毒，采用 50%组织培养感染剂量 TCID50 法测定病毒滴度。4.用 MOI=11 的腺病毒 Ad5/35-EVP1 感染293 细胞，4 d 后收集细胞培养上清液。采用硫酸铵盐析法和 Protein G 亲和层析对融合蛋白 EVP1 进行纯化。5.Western blotting 检测细胞培养上清液中融合蛋白 EVP1 的表达，ELISA 法检测细胞培养上清液中融合蛋白 EVP1 的含量。6.采用间接免疫荧光实验和 Octet Red 96 生物分子相互作用分析仪对融合蛋白 EVP1 的靶向结合特性进行定性和定量检测。结果：成功包装出腺病毒 Ad5/35-EVP1，滴度为 5.4 109PFU/ml。腺病毒 Ad5/35-EVP1-293细胞系统能有效表达融合蛋白 EVP1；MOI=11 时，融合蛋白 EVP1 的表达量为 1 613.94 24.65 ng/ml。蛋白 EVP1 与高表达 EGFR 的 A431 细胞和高表达 HER2 的人卵巢癌 SK-OV-3 细胞有良好的结合能力，与抗原 EGFR、HER2、VEGF 结合的亲和力常数 KD分别为 4.55、18.70 和 0.63 nmol/L。结论：成功制备多靶向融合蛋白 EVP1，它能高效结合 VEGF、EGFR 受体家族成员，具有良好的抗肿瘤临床应用价值。实验表明，构 建 获 得 的 融 合 蛋 白 EVP1 与 VEGF，EGFR，HER2 的亲和力常数 Kd 分别达到 0.63，4.55 及 18.7 nmol/L，EVP1 与 VEGF 的亲和力高于阿瓦斯 汀(Kd 1.8 nmol/L)，与 EGFR，HER2 的 亲和力分别略低于艾比特思(Kd 0.39 nmol/L)、曲妥珠单抗(Kd 5 nmol/L)。EVPI 与双特异性抗体相比，结合不同靶标的单元相对独立，在结合一类抗原(如 VEGF)后仍保持结合另一类抗原(如 EGFR)的活性，可能具有更强的协同效应；结合的抗原范围更广(包括 VEGF 以及除 HER3之外的所有 EGFR 家族成员)，适合几乎所有类型肿瘤的治疗；选用的 Fc 段经过功能区的突变改造，能介导更强的、抗体依赖性的、细胞介导的细胞毒性效应，具有更长的体内半衰期；构成融合蛋白的各肽段均来源于人体天然蛋白，免疫原性低，不易产生中和抗体。因而，该融合蛋白具有潜在 的抗肿瘤临床应用价值。