抗-体-制-药.ppt

3 3、19601960年发现多发性骨髓瘤细胞有多种免疫球蛋白。年发现多发性骨髓瘤细胞有多种免疫球蛋白。由于病原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质，因此制由于病原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质，因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称为的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称为多克隆抗体多克隆抗体。易出现非特异性交叉反应。易出现非特异性交叉反应。4 4、19751975年年K K hler and Milsteinhler and Milstein等首次等首次利用利用B B淋巴细胞淋巴细胞杂交瘤技术制备出杂交瘤技术制备出 McAb.McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。在临床上主要用于诊断和治疗。McAbMcAb由一个B细胞克隆产生的，只能识别某一个抗原表位的高度特异性抗体。McAb 在免疫导向疗法中存在的困难（障碍）：在免疫导向疗法中存在的困难（障碍）：A、McAb均是均是鼠源性抗体鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有56h，难以，难以维持有效药物作用靶组织时间；维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的、完整的抗体分子的相对分子质量过大相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。织，达不到有效的治疗浓度。解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 A、降低、降低McAb的免疫源性；的免疫源性；B、降低、降低McAb的相对分子质量。的相对分子质量。5、1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体，鼠嵌合抗体，之后制备出了之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3。6、1994年年Winter创建了噬菌体抗体库 技术,以基因工程方法制备抗体并发展成抗体工程抗体工程。它是抗体它是抗体研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体。体。第二节第二节 单克隆抗体及其改造单克隆抗体及其改造（Monoclonal AntibodyMonoclonal Antibody）一、制备单克隆抗体的一般流程一、制备单克隆抗体的一般流程 McAbMcAb是将是将抗体产生细胞抗体产生细胞与具有与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的定簇的抗体，又是单一的B B淋巴细胞克隆产生的，故称为单淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。克隆抗体。1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫 免疫方法：体内免疫和体外免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物：免疫动物：BALB/c小鼠和小鼠和Lou大鼠大鼠 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本方法：取适量脾细胞（基本方法：取适量脾细胞（1 108）与骨髓瘤细胞）与骨髓瘤细胞（2 1073 107）进行混合，在）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间作用下诱导它们融合，时间控制在控制在2min以内，然后用培养液将以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释。用于细胞融合的骨髓瘤细胞的条件：用于细胞融合的骨髓瘤细胞的条件：1、融和率高、融和率高 2、自身不分泌抗体、自身不分泌抗体 3、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%50%，相对，相对分子质量分子质量4000为佳。相对分子质量在为佳。相对分子质量在4006000，浓度在，浓度在10%60%范围内的范围内的PEG都能使细胞发生都能使细胞发生融合。融合。为了提高融合率，在为了提高融合率，在PEG 溶液中加入溶液中加入DMSO（二甲基二甲基亚砜亚砜），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。严格限制接触时间。（1）细胞融合液中的细胞类型：）细胞融合液中的细胞类型：4或或5种。种。（2）如何去除脾如何去除脾-瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性培养基培养基 细胞融合后，可产生多种融合细胞，如脾脾脾脾、脾脾瘤瘤、瘤瘤瘤瘤的融合细胞，而且还有许多未融合的骨髓瘤细胞未融合的骨髓瘤细胞。这些细胞比脾脾瘤融合的杂交瘤瘤融合的杂交瘤细胞增殖更快，并能将其淘汰。为此，可再将融合后的细胞立即移入选择性培养基中进行培养。常用的选择培养基为HATHAT培养基培养基，它是用次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶配制的。其中氨基喋吟(A)能阻断DNA合成的主要途径，瘤瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾脾融合细胞和瘤细胞在这样的组织培养条件下，几天内亦迅速死亡。由于骨髓瘤细胞都是次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌吟(H)和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。在最适的培养条件下大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活。在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞。所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。常用的饲养细胞饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。一般认为饲养细胞能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故应用的较多。3 3、筛选阳性克隆与、筛选阳性克隆与克隆化克隆化 常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术放射免疫技术 常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到9696孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用克隆化时也要应用HTHT培养液，以后的克隆化可用不含培养液，以后的克隆化可用不含HTHT的的RPMI 1640RPMI 1640培养液。培养液。软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入态，可用吸管吸出，移入9696孔板培养。孔板培养。筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆与克隆化 因为抗体产生细胞只占所有脾细胞的5左右，所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。并检测大批标本。免疫酶技术免疫酶技术因不需进行放射性核素操作，方法简便，又适于检测大批标本等优点而被广泛采用。通过引入生物素亲和素等放大系统可进一步提高灵敏性。一般说来免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组织检测患者活检组织标本为目的的抗体时，免疫荧光法则更有意义，在筛选抗体的同时，还能对所识别的抗原进行定位判定。下面以酶联免疫吸附试验筛选抗破伤风毒素抗体为例进行说明。4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定染色体分析染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为细胞为6268，NS-1为为5464，有中部和亚中部着丝点。，有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反。反之，则反。5 5、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大量制备 （1 1）体外培养法：用于抗原免疫性极弱）体外培养法：用于抗原免疫性极弱 获得的抗体较少。多采用获得的抗体较少。多采用RPMI 1640RPMI 1640培养液，添加培养液，添加10%10%-20%20%胎胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100 100 g/mlg/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。生长。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。养法。无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达2 2 10107 7/ml,/ml,收集收集的单克隆抗体可达的单克隆抗体可达400 400 g/mlg/ml。如在培养液中加入微载体，细胞。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达密度可达10108 8/ml/ml。（2）动物体内诱生法：）动物体内诱生法：用于抗原免疫性较强。用于抗原免疫性较强。常用常用 基本程序：接种前基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降（降植烷）或用液体石蜡，然后注射植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，杂交瘤细胞，712d便有腹便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。难度。6 6、单克隆抗体的纯化、单克隆抗体的纯化 根据根据IgIg的类和亚类以及用途选择不的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。同的纯化方法。体外诊断试剂体外诊断试剂IgGIgG类类-沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析 IgMIgM类类-沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和亲和层析层析+阴离子交换层析，并注意除去毒素、阴离子交换层析，并注意除去毒素、病毒、核酸等微