大肠杆菌表达系统详细表格.ppt

1 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统 魔天记 2 1.1.大肠杆菌表达体系的组成大肠杆菌表达体系的组成 一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体表达载体和和宿主菌宿主菌两部分构成。为了改善表两部分构成。为了改善表达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功发展了许多表达载体和相应的宿主菌。发展了许多表达载体和相应的宿主菌。表达过程：表达过程：包含启动子、目的基因编码包含启动子、目的基因编码序列和转录终止序列的载体进入受体细胞后，序列和转录终止序列的载体进入受体细胞后，可以利用受体细胞的复制、转录和翻译体系可以利用受体细胞的复制、转录和翻译体系表达产生目的蛋白。表达产生目的蛋白。3 1.1 1.1 大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体 1.1.11.1.1 组成部分组成部分 1.1.启动子：启动子：最佳启动子具备的条件最佳启动子具备的条件 第一第一 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的表达量占细胞总蛋白的10%10%-30%30%以上以上 第二第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件的条件 第三第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。用廉价的诱导物而得以诱导。4 2.2.转录终止子转录终止子 启动子封堵作用启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。转录终止子还能增强转录终止子还能增强mRNAmRNA分子的稳定性，从而提分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。高蛋白质产物的水平。3.3.核糖体结合位点核糖体结合位点 能被核糖体识别的位点，转录成能被核糖体识别的位点，转录成mRNAmRNA分子后，核糖体分子后，核糖体在这一位点上结合。在这一位点上结合。5 4.4.转译起始序列转译起始序列 55-末端结构特征，决定末端结构特征，决定mRNAmRNA的转译起始效的转译起始效率。率。5.5.转译增强子转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。率。6.6.转译终止子转译终止子 mRNAmRNA转译终止必须存在终止密码子。转译终止必须存在终止密码子。大肠杆菌格外偏爱使用终止子大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAAUAA，尤其是在，尤其是在其后加上其后加上U U形成形成UAAUUAAU四联核苷酸的情况下，转四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。译终止的效率便会得到进一步的增强。6 启动子启动子 核糖体结合位点核糖体结合位点 转录终止子转录终止子 复制起点复制起点 7 常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体 1.Lac1.Lac启动子的表达载体启动子的表达载体 2.Trp2.Trp启动子的表达载体启动子的表达载体 3.P3.PL L启动子的表达载体启动子的表达载体 8 laclac启动子：控制编码启动子：控制编码 -乳糖苷酶的乳糖苷酶的lacZlacZ基因基因转录的序列，可以被转录的序列，可以被IPTGIPTG所诱导，所以加入诱导物所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。理论上，凡是具有包括控制区段在内的理论上，凡是具有包括控制区段在内的laclac操操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的体的条件。这类表达载体的最突出的特点特点是，含有是，含有一条足够大的编码一条足够大的编码 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的lacZlacZ基因片断。基因片断。因此，每当有一个克隆的外源因此，每当有一个克隆的外源DNADNA片断插入到这个片断插入到这个启动子之后启动子之后,仍保持着仍保持着lacZlacZ基因固有的读码结构时，基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和的多肽和 -半乳糖苷酶组成的融合蛋白质半乳糖苷酶组成的融合蛋白质.LacLac启动子的表达载体启动子的表达载体 9 10 质粒的构建：质粒的构建：将含有将含有laclac启动子的启动子的HaeHaeIII III 酶切片断，经平末酶切片断，经平末端连接，克隆到经端连接，克隆到经EcoR1EcoR1切割并对其粘性末端进行填切割并对其粘性末端进行填补修复的补修复的pBR322pBR322质粒上。质粒上。11 12 TrpTrp启动子的表达载体启动子的表达载体 色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被被3 3-吲哚丙烯酸诱导。这种表达载体的优点是，它吲哚丙烯酸诱导。这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于所合成的蛋白质产量高于laclac启动子表达载体系统，并启动子表达载体系统，并且是诱导型的。且是诱导型的。构建：构建：1.1.大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA的的5.4kb Hind5.4kb HindIII III 片断，片断，含含有有trptrp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、trpEtrpE基基因、因、trpDtrpD基因的部分序列。基因的部分序列。2.2.将此片断，克隆到将此片断，克隆到pBR322pBR322质粒的质粒的HindHindIII III 位点，位点，构建成了构建成了ptrpED3ptrpED3表达载体（含有两个表达载体（含有两个HindHindIII III 位点）。位点）。3.3.HindHindIIIIII部分酶切消化，将靠近部分酶切消化，将靠近EcoR1EcoR1位点的一个位点的一个HindHindIII III 位点，经核酸外切酶和位点，经核酸外切酶和S1S1核酸酶处理，消除掉核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体构建新的质粒载体ptrpED5ptrpED5-1.1.13 14 P PL L启动子的表达载体启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一动子之一.PLPL启动子：是负责启动子：是负责 DNA DNA分子分子转录的启动子之一。转录的启动子之一。PLPL启动子是可以被启动子是可以被 E.coli RNAE.coli RNA聚合酶所识别的强启动子，转而聚合酶所识别的强启动子，转而转录噬菌体转录噬菌体DNADNA。该启动子可以被。该启动子可以被 cIcI基因产基因产物所抑制。携带物所抑制。携带 PLPL启动子的载体使用温度启动子的载体使用温度敏感的敏感的E.coli cIE.coli cI突变体。在较低的温度下，突变体。在较低的温度下，突变体所产生的突变体所产生的cIcI蛋白可以抑制蛋白可以抑制 PLPL启动子，启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。因的转录。15 pPLc24pPLc24表达载体：表达载体：用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。这个质粒表达载体含有这个质粒表达载体含有MS2MS2-聚合酶基因开始的聚合酶基因开始的9898个密个密码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表达。达。在在MS2MS2-聚合酶基因下游，存在聚合酶基因下游，存在BamHBamHI I和和HindIIIHindIII 单切点。单切点。EcoRIEcoRI单切点靠近单切点靠近 P PL L启动子，处于转译起启动子，处于转译起始密码子之前。始密码子之前。16 17 T7T7表达系统表达系统 大肠杆菌大肠杆菌T7T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为称为T7T7表达系统。表达系统。T7T7噬箘体基因噬箘体基因1 1编码的编码的T7 RNAT7 RNA聚合聚合酶选择性的激活酶选择性的激活T7T7噬箘体启动子的转录。它是一种高噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的活性的RNARNA聚合酶，合成聚合酶，合成mRNAmRNA的速度比大肠杆菌的速度比大肠杆菌RNARNA聚聚合酶快合酶快5 5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNARNA聚合聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNAT7 RNA聚合酶和聚合酶和T7T7噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过录竞争不过T7T7噬箘体转录体系。最终受噬箘体转录体系。最终受T7T7噬箘体启动噬箘体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。子控制的基因的转录能达到很高的水平。18 CassettesCassettes和基因融合和基因融合 一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要E.coliE.coli核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达信号组成一个信号组成一个cassettecassette。某些某些cassettecassette载体，克隆的基因并不是直接的与核糖体结载体，克隆的基因并不是直接的与核糖体结合位点临近，而是在一段合位点临近，而是在一段E.coliE.coli基因之后，基因之后，E.coliE.coli的基因直的基因直接与结合位点相邻。外源基因的插入必须能够融合两个阅读框接与结合位点相邻。外源基因的插入必须能够融合两个阅读框架的方式进行，这样就产生了架的方式进行，这样就产生了杂交的基因杂交的基因。因此基因的表达产。因此基因的表达产物是一个蛋白质的杂交分子，包含物是一个蛋白质的杂交分子，包含E.coliE.coli阅读框架编码的短肽阅读框架编码的短肽和外源基因蛋白，这样一个融合的系统具有和外源基因蛋白，这样一个融合的系统具有四个优点四个优点：1)1)克隆基因的克隆基因的mRNAmRNA的高效翻译不仅依赖于核糖体结合位点的高效翻译不仅依赖于核糖体结合位点的存在，而且受编码起始的核苷酸序列的影响。这可能是链间的存在，而且受编码起始的核苷酸序列的影响。这可能是链间配对形成的次级结构可以影响核糖体与其结合位点的结合。如配对形成的次级结构可以影响核糖体与其结合位点的结合。如果相关的序列是由果相关的序列是由E.coliE.coli序列组成，可以避免这一可能性。序列组成，可以避免这一可能性。2)2)在融合蛋白中存在细菌肽可以稳定分子阻止被寄主细胞在融合蛋白中存在细菌肽可以稳定分子阻止被寄主细胞降解。降解。3)3)细菌片段可能含有信号肽，引导重组蛋白运输到胞外。细菌片段可能含有信号肽，引导重组蛋白运输到胞外。如如ompAompA或者或者malEmalE基因，这样重组蛋白可以被输出到细胞外，进基因，这样重组蛋白可以被输出到细胞外，进入培养基或者质膜空间。可以简化重组蛋白从培养物中纯化。入培养基或者质膜空间。可以简化重