血小板颗粒膜蛋白研究进展-吴国新.pdf

?综中华血液学 杂 志?年?月第?卷第?期述血小板颗粒膜蛋白研究进展吴国新血小板是血液循环内最小的无核 细胞成分,它 具有 丰富的胞内颗粒,在正常血循环中血小板处于静 息状态,受到 生理或物理刺激因子作用时,血小板发生活化,伸出伪足并释放胞 内颗粒 内容物,参与生理性止血或病理性血栓形 成等。血小板内含有的颗粒主要有三类?一颗粒、致密体和溶酶体。随颗粒内容物的释放,颗粒膜蛋白要整合到 活化血小板 质膜内,成为血小板活化的 标志,并参与止血、炎症及免疫 等反应?一?。我们就?一颗粒 膜蛋 白?、致 密体 膜蛋白?及溶酶 体 膜蛋 白?一?。,?一?及?一?的基础 与临床研 究作一概述。?一颗粒膜蛋白?一颗粒 为血小板内含量最多,内容 物最 丰 富的 颗粒,内含多种与 血小板功能相关的生物活性物质,随着抗人活化 血小板 的单 克隆抗体。一颗粒 膜蛋白?单抗研制,对?一?的结构与 功能有了较深 的认识。?可按其分 子 量分为二种?一?,?弓和?一?护,其 中?一?亦称血小板 活化依赖的 颗粒 膜外显蛋白?产或 称白细胞分化抗 原?。?。?一?的分布和表达?一?位于巨核细胞及静止血小板 内?一颗粒膜上,同时位于 内皮细胞?一?小体膜上,红白血病细胞?内,最近有报道?一?还存在于血小板 致密体膜上。当血小板或 内皮细胞 受 刺激活化时,?一?随?一颗粒内容物的释放而 与质膜融 合,能持久存 在于 活化血小板 质膜表 面,而 在内皮细胞 表面呈一过性表达,以刺激后?分钟为高峰,?分钟则在内皮细 胞表面消 失,可能是通过 细胞内摄“胞饮”作用被 移去。?一?在正常血小板表面仅有?个分子,而在凝血酶活化的血小板表面有?。个分子?,其表达 是释放 依赖 性,而与?“?、?!一?浓度、离子 强度及?值无关。?一?。的结构与功能?一?是一个 富含半 胧氨酸,高度糖化的整合蛋白质,分子骨架 由一条多肤链构成,?一?分析示?一?的分子量 为?万,还原 后分子量不变?。从人 脐静脉内皮细胞的。?八文库中分 离出来的包含全 部?一?序列的?克 隆可编码?个 氨基阮长耿酸,从?端开始的?个氨基酸具有疏 水性,可能代表蛋白质的信号肤,其后的?个氨基酸则为成熟跨膜型的?一?,从 多肤链的?端开始,依次刀植物凝集素?区,表皮生长 因子?区,?一?、补体调节蛋白重 复序列区,跨膜区和胞质区。其中?区为?一?的主要功能部位,参与细胞 间的相互作用,而?区 只是支撑?区的空间结构。?一?在蛋白质水平上还有二种不 同的形式,只是?一?调 节蛋白重复序列数目的不 同,其一 血小板释放?一颗粒 时它们都整合至质 膜表面,另一种 则是缺乏跨膜区域 的分子,称可溶性?一?,血小板活化时可溶性?要 释放到血浆内川,因此,?一?在蛋白质分子水平上存在 异质性。血小板?一?为选择素?超 家族 的成员之一,称为?一?,它的分子结构与内皮一白细胞粘附分子?,?一?或 称?一?及淋巴细胞 归巢受体?,?或称?一?如 小鼠的?一?抗原具有 同源性,它 们 均有?和?区,不 同 之 处只是?一?分子 中?一?调节蛋白重复序列只有?个,?中只有?个,而?一?具有?个。因此,把?一?,?及?一?统称为选择素,为一个新基因家族,它们位于 人类?号染色体长臂?区?带至?带。?一?具有介导活化血小板或内皮细胞与多种不同类型的 白细 胞 粘附功 能,包 括中性粒细 胞 及单核细胞?,嗜酸性及 嗜碱性 粒细胞困,这 种 粘 附依赖于?的存在,当 加 人?!一?时粘 附作用 消失,用纯化的?一?处理上述白细胞或以抗?一?抗体处理 活化血 小板后其相互间的 粘附随 之消失,结果说明?一?为活化血小板或 内皮细胞与白细胞相互作用的主要桥梁。?一?的临床意义?一?为血小板活化释放的特异标志 之一,随着?一?单抗 的制备,已建立了同位素标记单抗来检测体内、外血小板表面平均表达?一?分子数 的方法,或用荧光素标记单抗及流式细胞计数仪来分 析,江苏省血液研究所,苏州医学 院?。?中华血液学杂志?年?月第?卷第?期?一?阳性 血小板的百分率,来反映体内血 小板的活化程度。?等人闭用荧光 素标记的?一14 0单抗5 12来检测体外循环中血小板的 活化 程度,发现体外转流结束时血小板表面及血浆颗粒内荧 光抗体结合的量显著增多,我们应用GMP一14 0单抗52一5 1也建立了测定血小板表面及 血浆内GMP一14 0的二种试剂盒,并在临床多种具有血栓形成或有血栓形成倾向的疾病中进行了应用 8 j(见附表),发现GMP一14 0的测定能反映体内外血 小板的活化程度,由附表可见GMP-1 40的测定在急性心肌梗塞,体外循环,流行性出血热,哮喘发作等的诊断及疗效评估中有一定 应 用价值。血浆内GMP一14 0是血 小板或内皮细胞 的活化释放产物之一,其血浆浓度 的改变与血栓性疾病 有关,研究表明血 浆内GMP一14 0含量 的测定 也能反映体内血小板 的活化程度及血栓形成倾向(见附表)s,。附表某些临床疾病状态下血小板表面及血浆内GMP一14 0分子的改变表面GMP一141)血.浆GMP一140急性心肌梗塞l周内2 4个个不稳定型心绞痛1 1个个稳定型心纹痛8一一脑血栓形成急性期2 2一个流行性出血热休克及少尿期1 8个个糖尿病或伴有微血管病变4 8一个原发性血小板减少性紫瘫1 1一一体外循环转流结束1 3个个肾病综合症1 2个个哮喘发作1 4个个注:(个):显著高于正常组;(一):无显著差异GMP一14 0可作为体内血栓形成的标志及体内定位诊断的靶子,GMP一14 0只在活化血小板表 面表达,不被血浆蛋白所掩盖,不随时间推移而在活化 血小板表面消失,在活化血 小板表面 存在1100。个 单抗结合位 点,且与抗体呈高亲和力结合,因此,GMP一14 0可谓较理 想的导向靶子。Balabriea,户首次用GMp一240的多克隆抗体在 拂拂体内行血栓显像,其血栓与血液的放射活性比值在注入同位素标记单抗后 3 0分钟可 达 3 3:1(Exvivo),人体静脉血栓为3:1(体内);我 们 用52一51单抗对狗实验性股动、静脉 血栓显像也 获得了成功,其动脉血栓和T/B比值达18:1,静脉血栓为6:1 l,因此,GMP一14 0可作 为血栓特异性诊断的靶子,且这种诊 断技术具有定 位准确,血池背景 低,快 速等 优点,是一项十分有潜力的检测方法。同理,GMP一14 0可作为导向溶栓的 间接靶 子,缩短纤溶 剂与 血栓部 位纤 维蛋白间的距 离,我们用单 抗52一51的Fa h片段 与纤 溶剂尿激 酶的B链经化学双功 能 交联剂偶联后,体外血小板血栓溶解试验显示,Fa b一尿激酶嵌 合分子的溶栓率 较单独使用 尿激 酶高3一5倍,且消耗血浆 中纤 维蛋白原及纤溶酶原 的量显著减少.2,因此,这种新型的溶 栓剂不仅提高了溶栓率,而且增强了特异性。可以预计,随着人源化单抗 的制 备,鼠源性单抗的免疫 原性降低,利 用GMP一1 40作为血栓标志之一,可为人类血栓性疾病 的导向诊断及治疗提供一条新的途径。1.4GMP一3 3的研究:Metz ela ar等人 川最 近制备了一株抗人活化血小板a一颗粒膜的单抗RU U一SPI.7 7,其识别的抗 原分子量为3.3万,且 与还 原无关。在正常血小板表面存在4150士193 5个结合部 位,而凝血酶活化 的血小板表面有19050士5 12。个分子。GMP一3 3与GMP一14 0具有相似之处,它们均位于。一颗粒上,且在 活化血小板表面表达的分子数相近,但GMP一3 3不 同于GMP一14 0:免疫荧光显 示GMP一33不存在 于内皮细胞 Wei bel一palade小体上;正常血 小板表 面有4150个分子,而GMP一14 0分子 不 足100。个;GMP一3 3存在于每个血小板 表面,与血小板异质性无关,目前,GMP一33的结构、功能及其临床意义 还在 研究之中。2致密体膜蛋 白:Ge r r a r d等人山用纯化的致密体制 备了一 株只与致密体膜反 应 的单抗,命名为D、S,其识别 的抗原分子量为4万,称 为Granulophysin,在 缺乏致 密 体的Her-mansky一pudlak(Hp)综合征 患者血小板内不存在,Gr an uf ophy si n为一组新型的血小 板活化释放蛋白,它的结构及功能至今还不清楚。Sh ale v等人利用二株单抗 建立 了EL ISA法测定 患者血小板 内Gr am il叩hy si n的 含量,并对致 密体贮存池缺陷(a一SPD)综合征进行了研究,示Gr anu lophy si n的测定有助于a一SPD的诊断及亚型分类。3溶 酶体 膜蛋 白:血小板溶酶体在 许 多方 面不同于Q一颗 粒及致密体,溶酶体的释放需很强的刺激剂诱导(如高浓度的凝血酶或胶原),其释放 较a一颗粒及致密体慢且不完 全,释放最多仅为 6 0%。随溶酶体内容物 的释放,膜蛋 白与血 小板质 膜融合,成为另 一组新 的融合蛋 白。目前,溶酶 体膜蛋 白可 分为三 种 3 j,即溶 酶体膜蛋白(L IMP-CDo3)t,溶酶体膜相关蛋白(Lamp一l和Lamp一2)5二及溶酶体膜蛋白11(I一IMP1 1)。随着单抗及 多抗的制备,对溶酶体膜蛋白的性质有了一定的认识。3.1溶酶体膜蛋白的分子结构及功能:中华血液学 杂 志1994年3月第巧卷第3期I_IMP一c几”:cDo3抗原为溶酶体整合膜糖蛋 白,其分子量 为36万,包含 2 38个氨基酸,I_IMP一CD6 3为一种 新的结 构独特 的 糖蛋白,它同P24/C D。抗 原,白细胞C D3:和C Do3抗原,肿瘤相关抗原Co o2 9等组成一个新的家族,该家族成员在结 构上具有许多共同点,均含有4个跨膜区域,氨基酸的空 间构型相似,半胧氨酸残基的数目和分布 类似,与氨基端 相连的糖基化部位相对保守。该家族的生物学功能还不十分清楚,有研究提示该家族 可能参与信号的传递。Lamp,5:Lamp在结构上不同于L IMp一eD。,它由二个不同但高度同源 的蛋 白Lamp一1和Lapm一2组 成,Lamp一1和Lamp一2的氨基酸组成非常相似,均有一条含多个N型糖基化 的多肤核 心,膜外有 3 8。一3 96个氨基 酸,含有8个 半 眺氨 酸 残基,组 成4个 球形区域,Lamp分子只有 一个跨膜区及含 1 0一 1 1个氨基 酸的胞内短肤,Lamp一1的分 子量为 1 2万,lamp一2为n万。当Lamp分子内没有N型糖基化或合成障碍时,l.amp分子的半衰期较含 正常数目N糖基化 的lamp分子显著缩短.从而推测N型糖 基化可 能主 要参 与保护血小板免受酸性 水解酶的作用。I_IMPH:I-IMPH只存在于大 鼠,分子 量为7.4万,CDNA序列分析示I_IMP l l含有 4 78个氨基酸,具有二个跨膜区域.它同1爪m p无同源 性.在人类溶 酶体表面还未发现此类蛋白,其功能 还 不清楚。3.2溶酶体膜蛋 白的表 达与临床意义:L amp和L IMP一cD6。为二种人类溶酶 体具有的膜蛋白,在正常血小板表面仅有极少的分子表达,而 在凝血 酶活化 的血 小板表面,Lamp一l和Lamp一2的分子数将近1000个,而L IMP一Cno 3可达900013000个,因此,后者可作为血小板活化 的一种标志,但血循环 内嗜碱性 粒细胞在lgE介导下可表 达L IMP一CDo 3分子,与靶细 胞结合 的细胞毒T细胞 也可表达,可见其特异性欠 佳。在体外循环及血小板贮存研究中,发现 L I MP-C D63分子随库血的放置 而表达 增多.体外 循环 结束 时表达 显著高于转流前,在深静脉血栓形成及糖尿病中L IMP一cD63表达也显著增 多,提示I_IMP一CD6 3的测定有一定的临床价值,能否作为检测血 小板 活化理 想的临床指标之一尚待研究。参 考文献r)rolein(GM P一140)onthesurfaeeofaerivat edhum