软骨组织工程支架材料的胶原结构分析-李霞.pdf

中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第3期 20100115 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 15,2010 Vol.14,No.3 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN:ZLKHAH 385Biomaterials Engineering Research Center,Sichuan University,Chengdu 610065,Sichuan Province,China Li Xia,Studying for masters degree,Biomaterials Engineering Research Center,Sichuan University,Chengdu 610065,Sichuan Province,China L Correspondence to:Jiang Bo,Professor,Doctoral supervisor,Biomaterials Engineering Research Center,Sichuan University,Chengdu 610065,Sichuan Province,China Supported by:the National High Technology Research and Development Program of China,No.2006AA03Z438*Received:2009-11-21Accepted:2009-12-22 四川大学生物材料工程研究中心，四 川 省 成 都 市610065 李 霞，女，1980 年生，汉族，四川省郫县人，四川大学在读硕士，主要从事组织工程及生物材料研究。Lixia1024 通 讯 作 者：蒋波，教授，博士生导师，四川大学生物材料工程研究中心，四川省成都市 610065 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225(2010)03-00385-04 收稿日期：2009-11-21 修回日期：2009-12-22(20091121002/WZ)软骨组织工程支架材料的胶原结构分析*李 霞，陈 露，万法盛，李莉莉，蒋 波 Analysis of collagenous structures for cartilage tissue engineered scaffolds Li Xia,Chen Lu,Wan Fa-sheng,Li Li-li,Jiang Bo Abstract BACKGROUND:Various types of collagen affect differentiation and expression of chondrocytes in the process of tissue engineered culture for cartilage.The reliability of cartilage tissue engineering is determined by resource,structure and property of collagen.OBJECTIVE:To characterizing the structure of collagen type,and,to clarify the structural characteristics of collagen for cartilage tissue repairing and provide guidance for choosing cartilage tissue engineering scaffolds.METHODS:The type and collagen was obtained from neonatal calf skins,and type collagen was obtained from porcine articular cartilage.The differences of structures of collagen type,and were analyzed and compared by FTIR,DSC,SDS-PAGE and picrosirius-red staining.RESULTS AND CONCLUSION:The neonatal calf collagen type,and porcine collagen type had the similar functional group.The thermal denaturation temperature of the three type collagen was 104.2,99.7 and 92.5.SDS-PAGE analysis showed the collagen type percentage in collagen type was(11.290.91)%.Picrosirius-red staining exhibited that the collagen type was comprised red and orange raw fibers,with strongly birefringent.Collagen type was lax and thin,greenish fibers,but collagen type was red,loosely cancellated fibers.The functional groups and important characteristics of the three of collagen are similar.However,there are some differences in advanced structure.To analyze the relationships of collagen type,and is important to choose and prepare scaffolds for cartilage tissue engineering.Li X,Chen L,Wan FS,Li LL,Jiang B.Analysis of collagenous structures for cartilage tissue engineered scaffolds.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu.2010;14(3):385-388.http:/ http:/ 摘要 背景：在软骨组织工程化组织培养过程中发现不同类型的胶原材料影响软骨细胞的分化与表达，胶原材料的来源、结构及性质的稳定性决定软骨组织工程研究的可靠性。目的：表征型、型和型胶原的结构，阐明用于软骨组织修复的不同类型的胶原材料的结构特点，指导软骨组织工程支架材料的选取。方法：取来自新生小牛皮的型胶原、来自成猪关节软骨的型胶原及来自新生小牛皮的型胶原，分别将 3 种胶原材料进行傅里叶变换红外光谱、示差扫描量热法、SDS-PAGE 和苦味酸-天狼腥红染色分析，比较结构上的差异。结果与结论：新生小牛皮型和型胶原与成猪关节软骨型胶原具有相似的官能团，热变性温度分别是 104.2、99.7 和 92.5。SDS-PAGE 分析型胶原中型胶原的百分含量为(11.290.91)%。苦味酸-天狼腥红染色显示型为红色和橙色的紧密排列的粗纤维，有很强的双折光；型胶原为红色的疏松的网状纤维；型胶原为绿色的疏松的细纤维。3 种胶原的官能团结构和重要特征十分相似，但其高级结构有较大的差异，其相互关系的分析对软骨组织工程支架材料的选择和制备有十分重要的意义。关键词：支架材料；型胶原；型胶原；型胶原；软骨组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.03.002 李霞，陈露，万法盛，李莉莉，蒋波.软骨组织工程支架材料的胶原结构分析J.中国组织工程研究与临床康复，2010，14(3):385-388.http:/www.crter.org http:/ 0 引言 支架材料的结构特征影响种子细胞的分化与表达，在软骨组织工程研究中，已引起研究者们的高度重视。胶原蛋白作为支架材料有利于细胞的黏附、增殖和分化，并能刺激软骨细胞分泌软骨基质型胶原和糖胺聚糖。但是，近期发现以不同类型的胶原蛋白为基础的软骨支架材料应用于软骨细胞培养和体内缺损关节软骨修复时表现不同。用型和胶原海绵培养狗膝关节软骨细胞，发现在型胶原中软骨细胞能保持其软骨细胞形态并分泌大量的糖胺聚糖，而在型胶原中软骨细胞分化成成纤维细胞形态并具有较低的糖胺聚糖生物合成活动性1。在研究兔体内的全层关节软骨缺损修复时发现型胶原基质更利于软骨下区的细胞进入缺损区形成纤维软骨,而型胶原基质虽然引导进入缺损区的细胞较少，但主要分布在表面和软骨下区与骨的接触面并在表面形成软骨样组织2。Maeller等3分别用型和型胶原与糖胺聚糖共混物培养半 386 月板细胞。3周后观察发现两种胶原中细胞形态和密度与正常的半月板细胞一致，不同的是细胞主要集中在型胶原基质边缘，数量相对较少，分泌出较少的糖胺聚糖，而型胶原基质中细胞遍布，分泌的糖胺聚糖比型胶原高50%。观察还发现相同时期内，型胶原基质收缩至原来的50%，而型胶原基质未见明显收缩。在型和型胶原涂片材料上进行兔软骨细胞培养发现培养的第4天型胶原中细胞密集生长，密度明显大于型胶原4。产生以上不同现象的原因很多，就胶原支架材料分析主要是由于型和型胶原的结构和组成不同(型胶原中通常还伴有型胶原)导致软骨细胞有不同的分化与表达。因此，作者进行了型、型和型胶原的结构表征，阐明用于软骨组织修复的不同类型的胶原材料结构特点，指导软骨组织工程支架材料的选取。1 对象和方法 设计：对比观察。时间和地点：于2008-09/2009-09在四川大学生物材料工程研究中心胶原研究室(通过GMP认证超净室，十万级，局部达万级)完成。材料：实验方法：红外光谱分析：将样品溶液室温吹干成膜，用Sepectrum One FT-IR spectrometer直接进行红外检测,波数范围4 000400 cm-1。DSC检测：吹干成膜的胶原样品放入密封盘中，从室温加热升温至280，升温速率为10/min，样品室氮气流量20 mL/min，空密封盘做空白对照，应用TA Q2000差示扫描量热仪对样品进行测定。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：SDS-PAGE采用通常的不连续系统，并参考Hayashi 等5的方法改良用以分离1()。样品和样品缓冲液0.125 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),0.05 g/mLSDS,2.5 g/L溴酚蓝，0.25 L/L 甘油，25 g/L-巯基乙醇按11(体积比)混合，沸水浴5 min。浓缩胶浓度4%，分离胶浓度5%，其中分别加入8 mol/L 的尿素溶液使浓缩胶和分离胶中尿素浓度为3.6 mol/L。电泳缓冲液采用Tris-甘氨酸缓冲液。样品分别在80 V和120 V的恒压下电泳约1 h。电泳结束后，凝胶在1 g/L的考马斯亮蓝R-250染色液中染色2 h，并在乙酸-乙醇脱色液中脱色至背景无色。用扫描仪对凝胶片进行扫描，并用凝胶图片处理软件ImageJ 1.41o分别对1()和1()电泳条带进行积分，再根据Chan等6的公式计算出样品中型胶原所占的百分比。苦味酸-天狼腥红染色：将冷冻干燥后的型、型和型胶原样品在体积分数10%的甲醛中固定，常规脱水、浸蜡、包埋、切片(约5 m厚)。切片在二甲苯中彻底脱蜡，经各级乙醇(乙醇体积分数逐渐降低)至蒸馏水洗涤。洗涤的切片在1 g/L苦味酸-天狼腥红溶液中染色 1 h。染色后的切片在各级乙醇(乙醇体积分数逐渐升高)内脱