流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程.pdf

流式检测细胞凋亡流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡检测细胞凋亡.2 Annexin V 检检测测细细胞胞凋凋亡亡实验原理.2 实验用品.2 操作步骤.3 Annexin V Blocking.5 凋亡细胞的凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析断裂片段分析.7 DNA凋凋亡亡细细胞胞的的断断裂裂片片段段分分析析实验原理.7 实验用品.8 操作步骤.9 BrdU Flow Kits 检测细胞增殖检测细胞增殖.12 BrdU Flow Kits 检检测测细细胞胞增增殖殖实验原理.12 BrdU Flow Kits 试剂盒.12 结果分析.17 流式仪器设置指南.18 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡线粒体膜电位变化检测细胞凋亡.22 线线粒粒体体膜膜电电位位变变化化检检测测细细胞胞凋凋亡亡实验原理.22 实验用品.22 样本制备.23 结果分析.24 注意事项.24 Active Caspase-3 检测细胞凋亡检测细胞凋亡.26 Active Caspase-3 检检测测细细胞胞凋凋亡亡实验原理.26 实验步骤.27 结果分析.28 1 A An nn ne ex xi in n V V 检检检检测测测测细细细细胞胞胞胞凋凋凋凋亡亡亡亡 实验原理实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与 DNA 碎片检测比较，使用 Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以 Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如 PI 或 7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。实验用品实验用品 1.一次性1275mm Falcon试管。2.PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8C保存。3.微量加样器和加样头。24.Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat.No.66121E）：浓度为10，使用时，用稀释为1浓度的应用液。5.Annexin V试剂与核酸染料：Annexin V 核酸染料核酸染料 Annexin V-Biotin（Cat.No.65872X）Streptavidin-FITC（Cat.No.13024D）PI（Cat.No.66211E）或 7-AAD（Cat.No.34321X）Annexin V-FITC（Cat.No.65874X）PI（Cat.No.66211E）Annexin V-PE（Cat.No.65875X）7-AAD（Cat.No.34321X）6.FACS流式细胞仪：上样检测。7.CELLQuest软件：获取和分析试验数据。8.Annexin V检测对照管：Annexin V A-阴性对照 B-补偿 1 C-补偿 2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和 SAv-FITC PI 和 SAv-FITC PE 未染色细胞 Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞 Annexin V-FITC PI 操作步骤操作步骤 1.取 Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1 Binding Buffer缓冲液制成1106细胞/ml的悬液。3.Falcon试管中加入100 l细胞悬液。4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料：管号 名称 荧光标记 Annexin V 核酸染料：1 阴性对照-2 单阳 1 AV-FITC-3 单阳 2-PI 4 样本 AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（20C 25C）避光处放置15分钟。36.*使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时：h 1Binding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。h 1Binding Buffer缓冲液100l溶解SAv-FITC试剂0.5g，加入到细胞管中。h 轻轻混匀。h 加入5l PI，室温（20-25C）避光处放置15分钟。7.各试验管中分别加入1Binding Buffer缓冲液400l。8.1小时内上流式细胞仪测定结果。结果分析：结果分析：以下 4 个样本分别是阴性对照、Annexin V 单阳管、PI 单阳管和试验管。100101102103104FL1-Height1.001100101102103104Annexin1.002100101102103104FL1-Height1.003100101102103104Annexin1.004 4 Annexin V Blocking 待测细胞与未标记的重组 Annexin V 预孵育，然后进行实验，是 Annexin V细胞凋亡检测的质量控制。原理是预先阻断 Annexin V-FITC 的结合位点，这样可以证明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特异性。1.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1Binding Buffer缓冲液制成1106细胞/ml的悬液。2.在5ml的培养管中加入100l细胞悬液（约1105个细胞）。3.加入5-15g纯化的重组Annexin V。注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同阶段，其Annexin V位点饱和所需要的纯化的重组Annexin V含量不同。某些情况下，为达到最好效果，可以减少细胞数量，0.5105个细胞加5-15g纯化的重组Annexin V。4.轻轻混匀，室温反应15分钟。5.加入5l的Annexin V-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。6.各试验管中分别加入1Binding Buffer缓冲液400l。7.1小时内上流式细胞仪测定结果。8.结果分析：下图 A、B 为 Anti-Fas 抗体诱导 3 小时后的 Jurkat T 细胞,图 C、D 为未处理的细胞；图 A、C 为 Annexin V-FITC 染色的凋亡检测结果，图 B、D为 Annexin V Blocking 后的检测结果。5 PharMingen 推荐推荐 Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒细胞凋亡检测试剂盒 规格规格 货号货号 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I:Part A：Annexin V-FITC(100 tests)PI(2ml)1Binding Buffer 缓冲液(50ml)100tests 6693KK Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II(Annexin V Blocking):Part A：Annexin V-FITC(100 tests)PI(2ml)1Binding Buffer 缓冲液(50ml)Part B：Purified Recombinant Annexin V(100g)100tests 6710KK 6 凋凋凋凋亡亡亡亡细细细细胞胞胞胞的的的的 D DN NA A 断断断断裂裂裂裂片片片片段段段段分分分分析析析析 实验原理实验原理 在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一，就是细胞核酸内切酶激活，出现 DNA 断裂片段。核酸酶将染色质的高级结构断裂为 50-300kb 的片段，最终断裂为 200bp 大小的 DNA 碎片。DNA 碎片检测的方法是外源性 TdT 酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL”(terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling)。现在可以使用 APO-DIRECT Kit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于 DNA 断裂，造成 DNA 链 3-OH 增多的情况。在 APO-DIRECT 分析中，TdT 酶催化 DNA 单链和双链 3-OH 末端非模板依赖性的 dUTP FITC 掺入反应。由于采用了直接荧光标记的 FITC-dUTP，所以一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测 DNA 碎片。7APO-DIRECT Kit（Cat.No.6536KK）试剂盒：）试剂盒：Part A（4C 保存）PI/RNase A Solution Reaction Buffer Rinsing Buffer Wash Buffer Part B（-20C 保存）FITC-dUTP TdT Enzyme Negative Control Cells：已固定细胞 Positive Control Cells：已固定细胞 实验用品实验用品 1.一次性 1275mm Falcon 试管 2.蒸馏水 3.PBS 缓冲液：含 0.1%NaN3，过滤后 2-8C 保存 4.固定液：含 1%多聚甲醛的 PBS 缓冲液 5.70%乙醇 6.冰浴箱 7.微量加样器和加样头 8.APO-DIRECT Kit 试剂盒 9.流式上机检测 8操作步骤操作步骤 1.细胞固定：（1）用 PBS 洗细胞后，将细胞重悬于 1%多聚甲醛中，浓度为 1-2106/ml，冰浴30-60 分钟。（2）300g 离心 5 分钟，弃上清。（3）用 5ml PBS 洗细胞两次，重悬于 70%乙醇中，浓度为 1-2106/ml，冰浴 30-60分钟。（70%乙醇细胞悬液在-20C 放置 12-18 小时后进行细胞凋亡检测，得到的效果最好。细胞可以在-20C 保存几个月。）2.配制染色液，现用现配。DNA 标记液标记液 1 个测试个测试 6 个测试个测试 12 个测试个测试 Reaction Buffer 10.00l 60.00l 120.00l TdT Enzyme 0.75l 4.50l 9.00l FITC-dUTP 8.00l 48.00l 96.00l 蒸馏水 32.00l 192.00l 384.00l 总体积总体积 50.75l 305.50l 609.00l 3 细胞染色：（1）取离心管和 Falcon 试管，按标本顺序编号。9（2）取 1106细胞悬液加入离心管中，300g 离心 5 分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。质控细胞（质控细胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：）：混匀后取 1ml（细胞数约 1106/ml）加入离心管中，300g 离心 5 分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。（3）每管各加入 1.0ml Wash Buffer，洗细胞两遍，弃上清。（4）加入染色液 50l，混匀。（5）37C 温育 60 分钟（或者室温过夜），每 15 分钟摇匀一次。（非质控细胞37C 温育时间需根据不同情况有所凋整。）（6）各管加入1.0ml Rinse Buffer，300g 离心5 分钟，弃上清。重复两遍，弃去上清。（7）加入 0.5ml PI/RNase A Solution，混匀。若细胞浓度低，可将用量调整到0.3ml。（8）室温避光处反应 30 分钟。（9）3 小时内上流式细胞仪测定结果。4.结果分析：PI 测定细胞 DNA 含量，FITC-BrdU 测定调亡。做 DNA-W/DNA-A 点图和 DNA-A/FITC-BrdU 点图，进行数据获取。取单个细胞门（DNA-W/DNA-A 设门），分析 BrdU 直方图，获得细胞凋亡信息。同时，可分析细胞周期（DNA-A）与细胞凋亡（BrdU）的关系。10 5.阴性质控细胞 Negative Control Cells 和阳性质控细胞 Positive Control Cells：11B Br rd dU U F Fl lo oww K Ki it ts s 检检检检测测测测细细细细胞胞胞胞增增增增殖殖殖殖 实验