细菌内毒素的危害性及防治.pdf

?收稿日期:2004-09-01作者简介:陈军,男,生于1978 年,在读硕士研究生,主要从事微生物药理。张淑华,女,生于1947 年,研究员,硕士导师,主要从事微生物药理、抗生素耐药性研究。文章编号:1001-8751(2005)01-0044-06?细菌内毒素的危害性及防治?陈?军?张淑华(中国医药集团四川抗菌素工业研究所,成都 610051)?摘要:?很多抗生素会诱导革兰阴性菌释放大量的内毒素,细菌内毒素可通过两种途径进入血液循环导致内毒素血症,很多严重疾病都直接或间接与细菌释放的内毒素有关。许多学者研究发现了一些可以抑制细菌内毒素释放或抑制内毒素生物活性的物质如:溶菌酶、杀菌/渗透性增加蛋白、阳离子抗微生物多肽、NK 细胞溶素等,具有很好的开发潜力。关键词:?内毒素;?危害性;?防治中图分类号:?Q241?文献标识码:A?内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)成分,是革兰阴性菌的主要抗原性及致病性成分。内毒素具有广泛的生物活性,能引起严重的炎症级联反应。近年来越来越引起研究者们注意的问题是当前临床使用的大多数抗生素在治疗细菌感染(主要是革兰阴性菌感染)时由于杀菌/抑菌的原因而导致大量内毒素释放,使得病情恶化。很多研究者都致力于寻找或能抑制细菌内毒素释放、或能中和内毒素、或能抑制内毒素生物活性的物质,并取得了可观的成果。1?细菌内毒素的危害革兰阴性菌感染的危害性主要源自其释放的内毒素。内毒素结构在 20 世纪 90 年代中期就已经研究清楚(如图 1 所示),其结构中内脂A 和 2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)是内毒素的毒性部分所在。通常 LPS以完整的形式存在于细菌细胞外膜上,当其从菌体上游离下来 1、2,成为可溶性的游离 LPS 时具有广泛的生物活性,其活性是细胞壁上内毒素的 50 100 倍。研究还表明细菌内毒素可通过两种途径进入血液循环导致内毒素血症:一是外源性革兰阴性菌感染,二是肠道系统内源性革兰阴性菌转位。很多严重疾病2、3(如损伤、烧伤、心、肾、消化系统、呼吸系统、肿瘤、心血管手术、自动免疫等方面的疾病)都直接或间接与革兰阴性菌感染及其释放的内毒素有关。图 1?内毒素的结构示意图?44?国外医药抗生素分册 2005 年 1月第 26 卷第 1 期?极少量的内毒素刺激肌体时能增强特异性或非特异性免疫力,但大量内毒素进入肌体循环便可造成多种病理反应。内毒素的释放会引起一系列级联放大的炎症病理反应(见图 2)。即 LPS 在肌体内激活单核/巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、其他多种组织的实质细胞及补体系统,先后诱导大量肿瘤坏死因子(T NF-?)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12 等细胞因子和黏附分子及 NO 等炎性介质产生和释放,引起内皮细胞的损伤和屏障功能(即通透性)的改变,导致全身性炎症反应综合征(SIRS)和脓毒症发生,严重者可导致低血压、中毒性休克、弥漫性血管内凝血(DIC)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官功能衰竭(MOF 或称多器官功能障碍综合征,MODS)甚至死亡。大量研究表明:抗生素不但不能抑制内毒素的生物学活性 4,而且在治疗革兰阴性菌感染时会诱导大量内毒素释放 5 9,使该类疾病治疗的难度增加。图 2?系统炎症级联反应2?细菌内毒素防治2?1?溶菌酶(lysozyme,LZM)溶菌酶是一类由一百多个氨基酸残基组成的单链蛋白质,分子质量约为 12?98ku,其酶活性机制为破坏细菌细胞壁上的肽聚糖(peptidoglycan),削弱细菌细胞壁结构,使得细菌细胞因内压而裂解。具体地说是打断聚糖上 N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid,NAM)和 N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,NAG)之间的?-1,4-糖苷键。溶菌酶广泛存在于动、植物体内,不同种类的溶菌酶结构和酶活性强度不尽相同。人溶菌酶由 130 个氨基酸残基组成,分子质量为 1470,广泛存在于眼泪、唾液、血浆、黏膜、白细胞等体液或组织细胞中,其活性部位位于第 78 115 位之间的 28 个氨基酸残基序列,尤其是其中 9 个氨基酸残基具有杀菌活性。梁爱华10 12等人报道鸡蛋清溶菌酶本身不具有抑制细菌的活性,但与抗生素联合使用能减少内毒素释放和中和内毒素毒性及减轻内毒素所导致的炎症反应。2?2?杀菌/渗透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)BPI 是一种糖蛋白,主要存在于人和哺乳动物中性粒细胞(PMNL)的嗜天青颗粒中,还有少量存在于嗜酸性细胞的吞噬体或特殊颗粒中。BPI 具有杀灭革兰阴性杆菌及中和内毒素的活性,主要机制是 BPI 与存在于革兰阴性菌外膜的内毒素结合13,导致细菌外膜的通透性增加,从而达到杀菌的目的。BPI 与内毒素结合蛋白(LPS binding protein,LBP)具有同源性(约 44%的氨基酸残基相同),两者都能与 LPS 的内脂部分结合,前者与 LPS 结合后能抑制其生物毒理活性。周红等14报道,猪源 BPI 具有强大的结合并中和内毒素的能力,其结合能力随着 BPI 浓度的增加而增加。在体外肝库普弗细胞培养中,猪源 BPI 能够抑制?45?国外医药抗生素分册 2005 年 1 月第 26 卷第 1 期LPS 诱导的 TNF-?分泌,其抑制作用呈剂量效应依赖关系。郑江15等用 LD50剂量的 LPS 静脉注射攻击小鼠构建内毒素血症动物模型,再以 BPI 模拟肽的不同剂量按不同时间点静脉注射模型小鼠进行保护性治疗,结果也发现 BPI 模拟肽对内毒素所致小鼠死亡有明显的保护作用及预防作用,并有一定的量效关系及时效关系。到目前为止,已有多种重组的 BPI 或 BPI模拟肽问世,如已经申请专利的 BPI 模拟肽 10342,它是对 BPI 分子三维结构进行分析后进一步确定更小的功能区结构,模拟和设计 BPI 功能区结构模拟分子,然后通过化学合成,筛选得到的一个模拟肽分子,其分子质量仅为 BPI 的 N-末端 1 199 个氨基酸片段(rBPI23)的 1/10。还有重组 BPI 分子 rBPI2116和rBPI23等在 II-III 期临床试验中被证实有效,但其较大的用量、较高的成本使之难以推广应用于临床。有些抗原物质能刺激诱导人的 BPI 基因迁移17,使细胞分泌 BPI 蛋白,从而有效中和 LPS,显著减少炎症反应细胞因子的产生。2?3?阳 离子抗 微生物 多肽(cationic antimicrobialpeptides,CAP)阳离子抗微生物多肽是由白细胞表达的一类肽。这类多肽的多聚阳离子能与 LPS 上的阴性磷酸盐离子结合,从而竞争性地抑制 LBP 与 LPS 结合18,导致游离 LPS 不能得以转运,使其刺激信号不能得以传递。据报道一些天然抗阳离子多肽及合成类似物都具有阻碍 LPS 诱生 TNF-?、IL-6 等细胞炎性介质的能力。如人阳离子抗微生物多肽-1819(hCAP18)的分子质量为 19?3ku,其C-端 27 个氨基酸残基构成了一个稳定的、具有杀菌活性的结构域,能杀灭问号钩端螺旋体菌(Lepospira interrogans)和双曲钩端螺旋体菌(lepospira bif lexa),此结构域能与螺旋菌体和肠杆菌的外膜脂多糖结合。研究发现 hCAP18 包括三个区域:由 30个残基组成的信号肽;由 103 个残基组成的N-端结构域(功能不明)和由 27 个残基组成的 C-端 LPS 结合域。实验证明 hCAP18 能抑制 LPS 对单核细胞的活化,降低 LPS 对小鼠的致死毒性。当hCAP18 去掉其信号序列后,便成为一种名叫 LL-3720的抗微生物肽,LL-37 是人中性白细胞产生的一种 Cathelin 相关肽(Cathelin 为一种源于猪的 11ku的蛋白质,是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂,可与细菌脂多糖结合,具有抗微生物活性)。Turner 等发现 LL-37 与大肠埃希菌 O111?B4 内毒素具有很强的亲和力,用鲎试剂显色法测定并绘制的 LL-37 与 LPS 吸附等温线是典型的 S 型曲线,希尔图(Hill Plot)分析 LL-37 与 LPS 之间的结合数据是呈线性分布(r=0?992,希尔系数=2?02),表明 LL-37 与 LPS 之间的结合具有正协同关系。用圆二色光谱法测定发现 LL-37 在与磷脂 A 作用过程中,其构象会由无规则卷曲变成?-螺旋。T urner 等还发现 LL-37具有光谱抗微生物活性,它不只存在于中性白细胞中,在角化细胞中也可以诱导产生,这些都显示 LL-37 及其前体 hCAP18都具有保护皮肤和其他组织免受细菌入侵及 LPS 引起的毒性损害。目前已人工合成了 hCAP18 类似肽 hCAP18109 135、LL/CAP18、FF/CAP18 等19,体外测定 hCAP18109 135对螺旋菌的 MIC 为20?g/mL,LL/CAP18为 20?g/mL,FF/CAP18为 10?g/mL,hCAP18109 135杀灭钩端螺旋菌属的IC502?0 7?2?g/mL,MIC 5 20?g/mL。Dankesreiter等21构建了合成多肽LL-10-H-14,其中包含了两个分别来自鲎抗内毒素因子(limulusanti-LPS factor,LSLF)和内毒素结合蛋白(LBP)的内毒素结合域的复合体。这种重组的多肽能够很有效地抑制 LPS 与其受体 CD14 之间的结合,并且在注射内毒素15min 以后再用这种多肽治疗,都能降低TNF?的水平。研究还表明具有较大结合域的分子对内毒素的抑制比那些只有较小结合域的多肽分子要强。但 LL-10-H-14 的活性在体内只能持续约30min。2?4?血浆淀粉样P 组分(serum amyloid P component,SAP)SAP 是一种高度保守的血浆糖蛋白,广泛存在于淀粉样沉积物中。de-Haas 等 22报道 SAP 既能抑菌或杀菌,又能阻止 LPS 与HDL 结合或置换出与HDL结合的LPS,并提示 SAP 在机体对 LPS 及革兰阴性菌的应答可以起重要的平衡作用。de-Haas 等23研究表明 SAP 可抑制补体 C1q 和 LPS 的结合,进而抑制补体激活的经典途径,但不影响替代途径;Herbert等24报道鼠 SAP 结合 LPS 的能力远比人 SAP 低,但用 SAP 基因敲除小鼠和野生型小鼠分别感染同样的流感病毒,两组小鼠体重和存活率均无显著性差异,表明 SAP 对流感病毒没有影响;Noursadeghi 等 25报道大量注射人 SAP 不能明显扭转 SAP 基因敲除小鼠对LPS 的敏感性,表明 SAP 在体内不能很好地调理 LPS毒理活性,不仅如此,SAP 与致病性细菌结合使之在浸入中性粒细胞后表现更强的毒性。2?5?NK 细胞溶素26(NK Lysin,NKL)NKL 是从猪肠道组织提取的具有抗菌活性的一种多肽,分子质量为 8?93ku,由溶解性淋巴细胞产生。NKL 能溶解多种肿瘤细胞,还能与大肠埃希菌、铜绿?46?国外医药抗生素分册 2005 年 1月第 26 卷第 1 期假单孢菌、沙门肠杆菌等菌属产生的 LPS 结合,从而能抑制 LPS 与小鼠粒性细胞的结合和 LPS 对小鼠骨髓细胞的 影响。Andersson 等用 异硫氰 酸荧 光素(FITC)标记 LPS,再通过微孔包埋、免疫显色等手段从而证实 NKL 与 LPS 之间的结合是呈剂量依赖关系的,还发现内酯 A 强烈抑制 NKL 与 LPS 之间的结合,而细菌多糖却轻微抑制它们的结合,证明 NKL 与LPS 的结合很可能与内酯 A 部分有关(LPS 由内酯 A和多糖组成)。用 LPS 注射半乳糖胺敏感小鼠(50ng/鼠),72h 内有 80%的小鼠死亡,当 LPS 与 NKL 一起体外 37?孵育 30mi