用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术.pdf

中国生物工程杂志China Biotechnology，2013，33(7):103-111用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术*刘伯宁(华北制药集团新药研究开发有限责任公司 抗体药物研制国家重点实验室石家庄 050015)摘要近年来，用于单抗药物生产的动物细胞大规模培养技术发展迅速。此领域的技术进展集中在个性化培养基开发，工艺条件优化等方面。本文总结了用于提高重组抗体表达水平的常用方法，以及细胞培养工艺对抗体药物“关键质量属性”(聚体、降解、糖基化修饰、电荷变异等)的诸多影响。此外，细胞培养工艺在产业化过程面临着工艺放大与技术转移，定性研究与工艺验证等实际问题。未来大规模细胞培养工艺的开发，将进一步借助动物细胞的组学研究成果和新兴的“过程分析技术”。关键词重组抗体细胞大规模培养培养基优化工艺开发中图分类号Q511收稿日期:2013-04-07修回日期:2013-05-16*国家“973”计划资助项目(2012CB724502)电子信箱:liuboning801 gmail com目前，多种表达系统均可实现重组抗体的异源表达，但是抗体药物的产业化制备，始终以动物细胞大规模培养工艺为主1。1986 年首个治疗性抗体 OKT3TM上市之初，动物细胞表达水平普遍不足100mg/L。经过近三十年间发展，业内用于重组抗体生产的动物细胞培养工艺，无论细胞培养密度，还是抗体表达水平均提高五十倍以上。流加培养工艺中细胞密度可达 1 2 107cell/mL，日均产量 200mg/L/day 以上(最高可达700mg/L/D)，最终收液的容积产率可达 3 5g/L(最高达 13g/L2)，培 养 体 积 可 至 20000L(Lonza，Portsmouth/NHfacility)3;灌注培养工艺中细胞密度可达 2 108cell/ml，抗体容积产率最高达 25 40g/L(Percivia 公司 XDTM灌注系统4)。以上行业技术水平的飞速提升，既源于上游细胞系构建技术的突破5，也得益于细胞大规模培养工艺的日臻成熟。尤其是后者综合培养基开发，工艺优化，结合新型生物反应器的使用，实现了动物细胞的高密度、高表达培养，满足了临床上对于抗体药物“公斤级”产能的需求。1动物细胞培养的过程参数与培养模式动物细胞的体外培养，涉及生物反应器的物理参数(温度，pH，DO，DCO2等)、培养基的营养成分(葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、维生素等)的消耗，以及自身代谢产物(乳酸、氨、重组蛋白等)的积累与生理生化参数(细胞密度、活性，能荷等)的变化。作为重组抗体生产的“细胞工厂”，上述过程参数的改变会直接影响生产细胞系的活性与重组抗体的收率。比如:当乳 酸(58mmol/L)、渗透压(382 mOsm/kg)、氨(5 1mmol/L)参数超过其相应的阈值，细胞活性和抗体产量均会明显下降6。目前，业内已经对于细胞培养过程参数进行了深入的研究，在动物细胞大规模培养中下述参数的控制也已成定式(见表 1)。11流加培养方式及优化策略目前上市的重组抗体中绝大多数(如:EnbrelTM，HerceptinTM，ituxanTM，SynagisTM)是 采 用 流 加(fedbatch)培养工艺生产，这主要由于与之配套的生物反应器(搅拌罐、气升罐等)制造成熟，可线形放大(最大至20 000L)，操作简单等原因。但是，流加培养过程中会出现营养物质消耗、代谢废物积累，以及产品质量不稳定等问题。因此，流加培养工艺的优化主要集中在基础培养基、流加培养基以及流加策略上2，9-11，其优化的原则是根据细胞的代谢特点设计补料培养基，用于补充易耗成分，降低副产物积累12-13。12灌注培养方式及优化策略灌注培养模式(prefusion)下，反应器几乎可实现DOI：10.13523/j.cb.20130716中国生物工程杂志 China BiotechnologyVol 33 No 7 2013表 1动物细胞培养的过程参数与控制范围7-8 Table 1The parameter and control for animal cell culture process参数控制(或测定)范围检测手段控制策略物理参数温度pHDODCO2渗透压32 386 8 7 220%60%5%25%(40 180mmHg)270 330 mOsm/kg铂温度电极pH 电极DO 电极DCO2电极冰点渗透压检测仪PI/PID 程序控制通 CO2 或流加碱液搅拌转速、通气量等流加培养基及流加策略营养物质葡萄糖谷氨酰胺氨基酸核苷酸0 10g/L0 10mmol/L0 10mmol/L0 10mmol/L生化分析仪、酶试剂盒HPLCHPLC葡萄糖限制性流加谷氨酰胺限制性流加流加浓缩培养基代谢产物乳酸氨0 50mmol/L1 10mmol/L生化分析仪、酶试剂盒使用半乳糖替代葡萄糖使用丙酮酸、谷氨酸替代谷氨酰胺生理参数细胞密度与活性ATP105108/ml;70%0 5 5pg/cell台盼蓝染色-血球计数板法，活细胞技术仪，生物量电极等HPLC1)、SDS-PAGE2)、抗体蛋白抗体浓度纯度糖基化水平电荷变异01 10g/L聚体，降解等G0、G1F、G2F、Man5 等酸性变异、碱性变异ELISA3)、protein A HPLC4)、Western blot5)等SEC-HPLC6)HPLCiCIEF7)、IEF8)、CEX9)、HPLCNote:1)High performance liquid chromatography;2)Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis;3)Enzyme-linkedImmunosorbentassay;4)Protein aaffinity chromatography;5)Protein immunoblot;6)Size exclusion chromatography;7)Imaged capillary isoelectricfocusing;8)Isoelectric focusing;9)Cationexchange chromatography“恒化器”培养效果，细胞密度、蛋白产量可较流加模式提高数倍14-15。但是灌注培养细胞截留需特殊装置，工艺放大存在难度，其产业化应用的经济性尚存争议16-17。目 前，只 有 少 数 抗 体(如:eoProTM，emicadeTM，SimulectTM，SimponiTM，StelaraTM等)及易降解的重组蛋白(凝血因子)等使用该工艺。灌注培养工艺优化，主要集中在灌注培养基及灌流速度上18。其优化原则是通过降低灌流速度，提高培养基的利用率和产物的容积产率。此外，控制流加灌注工艺(controlled fed prefusion)同时具有流加工艺和灌注工艺的优点。该工艺对易产生代谢废物的营养进行限制性流加。根据细胞摄氧量的变化，流加氨基酸以满足高密度细胞的营养需求19。2用于提高重组抗体表达水平的方法动物细胞的高密度培养，有赖于合适的培养基以及适宜的反应器环境。因此，旨在提高重组抗体表达的工艺开发，主要集中在“个性化培养基”的开发以及过程参数的优化上。上述研究通常需要借助小型化反应器，如传统的三角瓶、孔板，转管(spintube)等。近年，新型自动化小 规 模 反 应 器(BioLectorTM，SimCellTM，Micro-24TM，ambrTM等)20 不断出现，此类装备不仅能模拟反应器的pH、DO、培养基流加等控制条件，而且能够实现试验条件的通量筛选，大大加速了细胞培养工艺开发的进程。如:SimcellTM可同时使用 180 个微型反应器(650l)进行工艺条件筛选21。Micro-24TM可在孔板规模(5ml)对 3L 反应器 pH，DO，温度等不同条件进行模拟22。21培养基优化方法早期的动物细胞培养基中常含有胎牛血清或小牛血清。近年工业用培养基的开发趋势，已经转向无蛋白(PF)、无动物源(ADCF)，甚至化学成分明晰培养基(CD)23。此外，抗体生产企业在培养基开发过程中，还应充分考虑培养基成本(通常 20$/L)、生物安全性与质量稳定性(避免动物源血清、植物源蛋白水解物)以及下游纯化工艺的兼容性等问题24。哺乳动物细胞对营养的需求差别很大，如:NS0 细胞的生长依赖于外源性胆固醇，杂交瘤细胞、CHO 细胞多为谷氨酰胺营养缺陷型。此外，即使基于同一宿主细胞所构建的的不同克隆，其代谢特点与营养需求也不尽相同。因此，在培养基的开发过程中需特别强调“个性化培养基”的概念，即:生产细胞系所使用的培养基应根据其代谢特点进行优化、定制。下述方法在用于培养优化均有提高重组抗体表达的报道。211组分滴定法组分滴定法(component titration)4012013，33(7)刘伯宁:用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术是通过设计培养基组分的浓度梯度，来确定其最优浓度。由于动物细胞用培养基成分复杂(常含有 70 种组分以上)，且存在“协同效应”。所以，该方法只适用优化培养中的个别组分(如胰岛素、水解物25、生长因子等)。2 1 2培 养 基 混 合 法培 养 基 混 合 法(mediablending)是通过对成分已知的原型培养基进行不同比例混合。借助 DOE(experiment design expert)软件进行试验设计与分析，快速确定最优培养基配方26。目前市售培养基优化试剂盒均是据此原理。2 1 3消耗组分分析法消耗组分分析法(spentmedia analysis)，通过对批式培养过程中各组分的消耗情况进行分析，及时补充易消耗组分，调整流加策略。该方法由于检测手段所限，主要用于葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等组分的优化27-28。214化学计量分析法化学计量分析法(stoichiometricanalysis)利用简化的数学模型，建立葡萄糖、氨基酸，维生素与细胞生物量与重组蛋白合成，以及能量代谢之间化学计量关系。据此进行初始培养基、流加培养基以及流加策略优化，可减少乳酸、氨的生产，该方法在上世纪九十年代提高重组抗体产量至 24g/L29-30。215理性培养基设计法理性培养基设计(rationalculture media design)，综合上述三种培养基优化方法。先对大量培养基候选物及混合配方进行筛选，利用最初确定的基础培养基进行批式培养，分析培养基中易消耗组分，据此设计流加培养基和流加策略。最后，利用组分滴定法确定流加培养基其他添加物(水解物)的最适浓度。最后，优化过的基础培养基、流加培养基及补料策略，在迷你反应器上进行验证。这也是大多数 CO 公司(Sigma，BD 等)开发定制培养基的主要方法31-34。216系统培养基开发法系统培养基开发(systematicapproaches)，是将培养基成分分为氨基酸、维生素、核苷酸等若干组，首先判定对细胞表达影响较为显著的组别，再针对该组别进行重点的成分优化。35-36 22两相培养与代谢转化绝大多数重组蛋白的生产采用“两相培养工艺”(biphasic culture process)，该工艺中“生长期”与“生产期”采用完全不同的控制策略，如降温、调节 pH，改变流加策略等(见表 2)。此工艺中细胞的代谢状态发生明显的变化，称之为“代谢转化现象”(metabolic shift)即:生长期细胞代谢旺盛，产生大量乳酸，而进入生产期后，细胞生长受到抑制，乳酸产量随之变小，直至消耗。23促进异源蛋白表达的小分子物质某些小分子化合物可以通过改变细胞周期，促进重组蛋白的表达(见表 2)。直接在培养基中添加这种物质，是提高目的蛋白产率的简便方法。此类物质中丁酸钠(NaBu)和二甲基亚砜(DMSO)应用最多。表 2细胞培养中用于提高重组抗体表达的方法和物质Table 2The summary of methods and compositions used for improving recombin