细胞谱系示踪技术.pdf

细胞谱系示踪技术倡李晓刚苏楠杜晓兰陈林，（第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室，骨代谢与修复中心，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室；康复理疗科，重庆）摘要细胞谱系示踪（）是指利用各种方式标记细胞，并对包括其后代所有细胞的增殖、分化以及迁移等活动进行追踪观察。自 世纪以来，谱系示踪技术为研究器官发育、组织损伤修复以及单细胞的分化命运提供了重要的手段。近些年，随着基因工程技术的飞速发展，细胞谱系示踪技术也有所突破，尤其是诱导性重组酶 系统的应用，极大地拓宽了细胞谱系示踪技术的应用范围。本文将结合细胞谱系示踪技术在多种研究中的应用，对该技术的原理、特点以及最新进展做一综述。关键词谱系示踪；基因打靶；活体示踪中图分类号；Cell Lineage Tracing-，-，（State Key Laboratoryof Trauma，Burns and Combined Injury，Center of Bone Metabolism and Repair，Institute of Surgery Re-search；Department of Rehabilitation Medcine，Daping Hospital，Third Military Medical University，）Abstract ，-，-，-，-Key words；多细胞生物的生长发育基于细胞分裂和分化。在哺乳动物的胚胎发育早期阶段，每个细胞就已经被赋予了特定的分化潜能（），这种特性在后期发育过程中才逐渐表现出来，最终分成为不同的组织、器官类型。另外一方面，某些终末分化的成体细胞在一定的生理或者病理条件下会发生去分化（）或者转分化（-），变为另外一种细胞或组织类型，例如肿瘤的发生、心脏成纤维细胞再编程转分化为心肌细胞等现象。细胞的命运决定是指单个细胞及其所有后代细胞的分化和发育活动，对细胞的命运决定进行追踪和观察称为细胞谱系示踪。细胞谱系示踪和广义上的细胞示踪（）有本质区别，细胞谱系示踪所要研究的问题是一种细胞的命运改变过程，其根本是发育问题。但细胞示踪是一个较笼统的概念，指标记和追踪细胞。对于细胞示踪技术的探索起源于 世纪初，早在 年，等利用了海鞘胚胎早期分裂球着色差异的特性，对分裂球的分裂过程进行观察，等则应用了慢速摄影（-）技术拍摄活体胚胎的发育。此后，研究者尝试利用水溶性染料、脂溶性染料、过氧化物酶以及荧光染料等，通过物理的方式注入到细胞内对其进行标记追踪，尽管这些技术手段解决了当时的一些问倡国家重大科学计划（）（），国家自然科学基金项目（，）资助课题通讯作者生理科学进展 年第 卷第 期题，然而在现在看来还存在许多缺陷。首先通过物理的方法无法保证精准地标记目标细胞；其次，在细胞的分裂过程中标记染料会被逐渐稀释直至消失，传统的标记手段也无法有效的对单个细胞及其后代细胞进行永久的标记。随着基因工程技术的成熟，利用基因打靶技术的细胞谱系示踪逐渐发展起来。首先，在示踪标记物的应用方面，内源性遗传标记物取代外源性标记物，该类标记发生于基因水平，能够克服传统标记物的局限和缺点；其次，在标记的方式上也有很大突破，由“宏观”的物理标记法逐渐转变为“微观”的基因打靶标记，这从根本上解决了物理标记过程造成细胞损伤以及随着传代标记会被稀释的问题；最后，在追踪手段上，通过借助光学显微镜，可在活体内对细胞进行追踪和观察。一、细胞示踪标记方法及应用（一）遗传性标记物遗传性标记物是指由基因编码的可以稳定遗传的，并且其本身具有易识别性的标志分子。除此之外，还具备无毒性、不影响细胞本身代谢和结构的优势。荧光素酶：将荧光素酶基因整合入细胞，表达荧光素酶，通过控制底物，可以观察到被标记细胞发光现象，波长范围在 ，其发光本质为酶催化底物的化学发光反应。目前常用的荧光素酶有北美萤火虫萤光素酶（-）和海肾萤光素酶（），荧光波长分别为 和 。由荧光素酶催化底物发光的方式不需要激发光，光能来源于酶催化反应，因此发光只发生在活体细胞内，它很大程度上避免了激发光造成的光噪现象。这种发光方式具有一定的组织穿透性，等在体外利用携带荧光素酶基因的质粒转染神经祖细胞，之后移植到裸鼠大脑内，通过应用荧光素酶底物结合成像设备观察到神经祖细胞向胶质瘤的迁移活动。然而，荧光素酶的缺点是其催化发光极易淬灭，同时底物也具有免疫原性，并且不适用于固定的标本中发光。荧光蛋白：最早的荧光蛋白由 等（）在 水母体内发现，随后相继发现了 多种波长不同的荧光蛋白，包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白及橙色荧光蛋白等。与荧光素酶催化底物发光的方式不同，荧光蛋白不需要注射底物，发光的原理是自身蛋白构象在较高能量激发光激发时发生构象改变而引起。荧光蛋白由于荧光信号强，便于观察追踪，现已广泛应用示踪研究中，其中最常用的荧光蛋白为绿色荧光蛋白，尽管其荧光强度较红色荧光蛋白稍弱，但它对细胞毒性最小。另外，串联型二聚体-也是一种常用的荧光蛋白，它是红色荧光蛋白的变异体，具有强于绿色荧光蛋白的荧光强度，并且能很快降解成单体减少对细胞毒性作用。然而，荧光蛋白的局限在于荧光发光必须依赖于激发光，因此荧光信号极易受到周围组织干扰。最近 等人研究了一种新型自主发光蛋白-，这种新型蛋白是由海肾荧光素酶和一种具有高效生物发光共振能量转移性的荧光蛋白融合而成，它能够在活动小鼠体内显示清晰地显示荧光信号，以观察体内单细胞、或者特定组织器官的生理活动情况。除此之外，利用 位点特异性重组系统构建的双荧光 mT mG 小鼠也基于荧光蛋白的特性，它能够在 的作用下改变荧光颜色，从而提高了细胞在组织内分辨率。-半乳糖苷酶（-，-）：-半乳糖苷酶是 基因的表达产物，已广泛应用于基因表达调控研究。-半乳糖苷酶可催化乳糖水解，用-为底物进行染色时呈蓝色，这一特性使其易于观察和检测。但是它最大的缺点为不能在活体内观察。综上所述，遗传性标记物与以往传统的细胞标记物最大的区别在于它不会向临近细胞污染扩散，能够稳定的表达，并且随着细胞的分裂，标记也会遗传给子代细胞。在研究中，除上述三种最常见遗传标记物之外，还有很多其他类型遗传标记物，例如碱性磷酸酶、-等，。然而，不同的遗传性标记物都有其各自的特点，应根据研究目的选择合适的标记物，另外还需考虑标记物对细胞本身的影响，研究的组织类型以及实验动物等因素。（二）标记方式 转染和转导技术的应用：转染（）指真核细胞由于外源 掺入而获得新的遗传标志的过程。外源基因进入细胞主要有四种方法，包括电击法、磷酸钙法、脂质体介导法以及病毒介导法。等（）利用脂质体将荧光素酶 转染到爪蟾胚胎的脑神经元中，观察视网膜发育过程中神经元分化命运。等（）则运用电转的方式将外源标志基因转入禽类胚胎中。尽管目前转生理科学进展 年第 卷第 期染技术越来越成熟，但由于转染对细胞伤害性较大，会影响细胞正常的生长发育，加之遗传标记在细胞内表达效率及稳定性等问题，导致该种方式应用较少。运用病毒转导（）是将外源基因整合入目的细胞的另外一种方式。这种源于细菌遗传学的研究手段已经应用于哺乳动物的细胞示踪。-等在体外利用逆转录病毒将-基因转导入小鼠造血干细胞，然后将其注射给受大剂量射线辐照的小鼠，进而追踪被标记的外源造血干细胞在体内的活动情况。然而这种传统的逆转录病毒转导方式只能是在体外进行操作。（-）系统可以在体内指定时间和特定部位控制逆转录病毒将外源基因转导入细胞内，它的主要原理为 （-）病毒只能感染表达禽类 受体的细胞，通过控制病毒感染时间和应用组织特异性表达 受体的小鼠品系 ，能够实现对转导时空特异性控制。目前，系统已经成熟应用于细胞示踪研究，等利用 系统将碱性磷酸酶 整合入小鼠大脑室下带星形胶质细胞内作为标记，发现室下带星形胶质细胞在正常条件和损伤修复时均有神经干细胞的特性。与转染质粒相比，逆转录病毒感染对细胞毒性小，但是它主要的问题是只能标记有分裂能力的细胞，另外一方面，逆转录病毒载体也会发生表达沉默的现象，且实验操作难度较大。转基因与基因打靶技术的应用：基因打靶技术是建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术上的一种定向改变活体生物遗传信息的实验手段，它能使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传并且稳定表达。自上世纪 年代第一例基因剔除小鼠产生以来，基因打靶技术发展迅速，给生命科学领域研究带来革命性的变化。细胞谱系示踪技术需要体内对特定的组织、细胞类型在特定的时间段进行标记，而基因打靶技术中的位点特异性重组酶（，）系统可以满足这种需求。主要有两个成员：来自埃希氏大肠杆菌噬菌体 的 重组酶系统和来自酵母的 系统。两种系统原理相似，都是在特异性位点切割和连接，然而两种系统相比以 重组酶系统重组效率上更高。重组酶由 等在 噬菌体中发现，是一种特异性重组酶，能够介导由 的“”铆定的基因序列特异性重组，完成对同向“”序列所铆定基因片段的切除以及对向“”铆钉基因的倒位，。等人最早将 系统应用于体内细胞谱系示踪研究，。他们在研究大脑发育过程中构建了两种转基因小鼠，一种是在 -基因的启动子后插入标志基因，该标志基因的表达被一段由同向“”铆钉的“”序列所干扰，另外一种小鼠则是在（）启动子后插入 基因。当这两种转基因品系的小鼠杂交后，表达 的细胞会产生 酶，进而切除“”序列，标志基因 就能成功表达。利用该方法，等人证实了 阳性的细胞在小鼠中脑发育中的重要作用。此后，等构建了在-位点插入 报告基因的基因定点敲入小鼠，该小鼠基于 基因捕获（-）小鼠品系，定点敲入的 基因上游插入被同向“”位点铆钉“”序列，从而指示 表达。该小鼠与转基因小鼠相比，敲入基因表达效率更高，并且不会干扰其他基因的正常表达。与以往的细胞示踪手段相比，系统的标记方式具有良好的靶向性，只会在表达组织特异性启动子的细胞内发生，很大程度上避免了错误标记的问题。此外，系统最大的优点是对基因组进行了修饰，具有遗传特征，发育过程中表达过 的细胞以及其后代所有的细胞都会被永久地标记。然而，这一特点也导致无法对标记时间进行控制。为了解决标记时间特异性的问题，等在 基础上制作了一种新的小鼠模型，这种模型利用了雌激素受体为核受体的性质，借此调控 入核的时间。该模型中的 与经修饰的人类雌激素受体配体结合域融合在一起表达（-），该受体不结合雌二醇，对他莫昔芬（-）有亲和性。在没有他莫西芬的状况下，由于雌激素受体停留在细胞质中，导致 也无法进入细胞核，只有在外源性他莫西芬的条件下，才能伴随雌激素受体进入细胞核，实现对 片段的重组修饰。因此，只要控制他莫西芬的注射时间就能实现对敲除事件进行时间上的控制（图）。等，利用-基因敲入小鼠和生理科学进展 年第 卷第 期-小鼠交配后（图），在一定的时间段内注射他莫西芬，使在该时间段表达 的细胞被 永久标记。通过观察被标记细胞的活动情况，发现在 天内表达 的细胞会逐渐分化为各种类型的肠道上皮细胞，证明了 基因特异性地在肠道上皮干细胞中表达，提示其为肠道干细胞的标志基因。图 1-原理及应用（修改自 等，瞷 ）综上所述，系统已经成为条件性基因调控的较理想工具，并且已经成熟地应用于细胞示踪研究。然而，并不是所有的启动子都能特异性地表达于单一类型的细胞，示踪研究中用来驱动 表达的启动子往往会同时表达于多种细胞或者组织类型，这样就不利于研究特定细胞的活动。-等设计了“-”系统，在这种系统中 被分做 端和 端两部分，两者分别由两种不同的启动子驱动表达，当两者同时出现在同一种细胞时，才会形成有功能的（图）。以此为基础，研究者利用神经胶质原纤维酸性蛋白（gfap）和髓鞘蛋白脂蛋白（plp）启动子分别驱动 酶的 端和端表达，通过构建转基因小鼠，与-报告小鼠交配后追踪神经胶质祖细胞。这种方法很大程度避免了 在目的细胞之外的组织表达的问题，但是目前应用还比较少，有待进一步地研究。图 2-示意图（修改自 等，瞷）复合式标记：相比单一标记的基因报告小鼠，复合式标记方式能更好地指示目的细胞的位置。最早的复合式标记小鼠包括 和 ，两者都是基于 系统建立的。小鼠中由于“”铆钉的 基因干扰其后的 表达，因此在表达活性 之前所有细胞呈 染色阳