动物细胞培养.ppt

动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞融合动物细胞融合 生产单克隆抗体生产单克隆抗体 动物细胞核移植动物细胞核移植 动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术 其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础 学学 习习 目目 标标 动物细胞培养动物细胞培养 定义、过程、条件、应用定义、过程、条件、应用 动物体细胞核移植技术动物体细胞核移植技术 定义、过程、应用、存在问题定义、过程、应用、存在问题 一、动物细胞培养一、动物细胞培养 1.1.概念：概念：细胞增殖细胞增殖 动物细胞动物细胞培养就是培养就是从动物有从动物有机体中取出机体中取出相关的相关的组织组织，将它分散成，将它分散成单个细胞单个细胞，然后放，然后放在在适宜的适宜的培养基培养基中，中，让这些让这些细胞生长和细胞生长和增殖增殖。2.2.原理：原理：3.3.过程过程 取出组织取出组织 胚胎或幼龄动物的器官组织胚胎或幼龄动物的器官组织 剪碎组织剪碎组织 胰蛋白酶胰蛋白酶或胶原或胶原蛋白酶蛋白酶处理处理 单个细胞单个细胞 制成制成细胞悬液细胞悬液 转入培养瓶内转入培养瓶内（培养液）（培养液）置于适宜环境中培养置于适宜环境中培养 加培养液稀释加培养液稀释 动物组织细胞间隙动物组织细胞间隙中含有一定量的中含有一定量的弹弹性纤维等蛋白质，性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形将细胞网络起来形成具有一定弹性和成具有一定弹性和韧性的组织和器官韧性的组织和器官 胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理 取出组织取出组织 胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织 剪碎剪碎 单个细胞单个细胞 细胞悬液细胞悬液 细胞贴壁细胞贴壁 接触抑制接触抑制 转入培养瓶转入培养瓶内内（培养液）（培养液）置于适宜环置于适宜环境中培养境中培养 思考：转入培养思考：转入培养瓶内培养会发生瓶内培养会发生哪些现象？哪些现象？细胞贴壁：细胞贴壁：悬液中分散的细胞很悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿的培养瓶或培养皿的内表面光滑、内表面光滑、无毒、易于帖附。无毒、易于帖附。细胞进行有丝分裂，细胞进行有丝分裂，数量不断增多。数量不断增多。接触抑制接触抑制 当贴壁细胞分裂当贴壁细胞分裂生长到生长到表面相互接表面相互接触时，触时，细胞就会细胞就会停停止止分裂增殖，分裂增殖，这种这种现象称为细胞的接现象称为细胞的接触抑制。触抑制。取出组织取出组织 胚胎或幼龄动物的器官组织胚胎或幼龄动物的器官组织 剪碎组织剪碎组织 胰蛋白酶胰蛋白酶或胶原或胶原蛋白酶蛋白酶处理处理 单个细胞单个细胞 制成制成细胞悬液细胞悬液 加培养液加培养液 转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养 （细胞贴壁；接触抑制）（细胞贴壁；接触抑制）原代原代培养培养 定义：定义：人们通人们通常将动物组织常将动物组织消化后消化后的的初次初次培养培养称为原代称为原代培养培养 动物组织块动物组织块 细胞悬液细胞悬液 原代培养（细胞贴壁；接触抑制）原代培养（细胞贴壁；接触抑制）传代培养传代培养 胰蛋白酶处理分散成单个细胞胰蛋白酶处理分散成单个细胞 幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎 加入培养液加入培养液 用胰蛋白酶用胰蛋白酶等处理贴壁细胞；等处理贴壁细胞；分瓶分瓶继续培养。继续培养。适宜条件适宜条件 当原代培养的细胞处当原代培养的细胞处于于接触抑制后接触抑制后，用，用胰蛋白酶胰蛋白酶处理，使处理，使细胞从瓶壁上细胞从瓶壁上脱离脱离下来，然后加入下来，然后加入新新的培养液，的培养液，将细胞分离稀释，将细胞分离稀释，并从原并从原培养瓶内转接到培养瓶内转接到新的培养瓶内新的培养瓶内，这个，这个过程称过程称传代培养传代培养（分瓶培养的过程）。（分瓶培养的过程）。传代培养传代培养 1010代细胞代细胞 5050代细胞代细胞 传代传代培养培养 细胞株细胞株 无限传代无限传代 细胞系细胞系 遗传物遗传物质已改质已改变变 遗传物质遗传物质未改变未改变 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 配置细胞悬液配置细胞悬液 胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理 转入培养瓶转入培养瓶 单个细胞单个细胞 加培养液稀释加培养液稀释 分分 瓶瓶 原代原代培养培养 原代培养特点：原代培养特点：细细胞贴壁、接触抑制胞贴壁、接触抑制 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 配置细胞悬液配置细胞悬液 胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理 1010代细胞代细胞 转入培养瓶转入培养瓶 4040-5050代细胞代细胞 传传代代培培养养 无限传代无限传代 单个细胞单个细胞 加培养液稀释加培养液稀释 传代传代1010代以内，代以内，遗传物质不改遗传物质不改变，变，保持正常保持正常二倍体核型。二倍体核型。分分 瓶瓶 继续传代培养继续传代培养少部少部分分细胞细胞获得不获得不死性，死性，细胞突变，遗传物细胞突变，遗传物质已经改变，质已经改变，等同等同于癌细胞。于癌细胞。细胞株：细胞株：一般说一般说遗传物质未改变遗传物质未改变 细胞系：细胞系：遗传物质遗传物质已改变已改变 原原代代培培养养 动物细胞培动物细胞培养的原理：养的原理：细胞增殖细胞增殖 为什么选用动物胚胎或幼龄个体为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？的器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。分裂能力强，分化程度低。为什么培养前要将组织细胞分散为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。积，利与细胞吸收营养。1010代以内的细胞遗传物质不代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。改变，保持正常二倍体核型。目前使用的或冷冻保存的正常目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在细胞通常在1010代以内，为什么？代以内，为什么？动物细胞培养动物细胞培养能否像能否像绿色植物组织绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。增多，不能发育成新的动物个体。4.4.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件 1 1）无菌、）无菌、无毒的环境：无毒的环境：适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度人和哺乳动物细胞最适温度为为36.536.50.50.5 适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：PHPH：7.27.2-7.47.4 液体合成培养基：液体合成培养基：（葡萄糖葡萄糖、氨基酸）、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加等；通常还需加血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。4 4）气体环境：）气体环境：2 2）营养：）营养：3 3）温度和）温度和pHpH：“9595空气空气+5+5COCO2 2”的混合气体培养箱。的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；氧气是细胞代谢必须的；COCO2 2维持培维持培养液的养液的pHpH。对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液培养液中中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中污染；防止培养过程中污染；定期更定期更换培养液换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。造成危害。动物细胞培养液的主要成分是什么？动物细胞培养液的主要成分是什么？较较植物组培植物组培培养基有何独特之处？培养基有何独特之处？主要成分：主要成分：葡萄糖葡萄糖、氨基酸、水、无机、氨基酸、水、无机盐、维生素和动物血清等。盐、维生素和动物血清等。独特之处有：独特之处有：1.1.液体培养基液体培养基 2.2.成分中有动物血清等成分中有动物血清等 加入动物血清原因：加入动物血清原因：提供一个类似提供一个类似生物体内的环境；生物体内的环境；含营养物质含营养物质（如（如生长因子）生长因子）促进细胞发育。促进细胞发育。用用胰蛋白酶分散细胞胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间物，说明细胞间物质主要成分是什么？质主要成分是什么？用胃蛋白酶行吗用胃蛋白酶行吗？在进行动物细胞培养时，用胰蛋在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明白酶分散细胞，说明细胞间的物质细胞间的物质主要是蛋白质。主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的动物细胞培养适宜的PHPH为为7.27.27.47.4，此环境下胃蛋白酶（此环境下胃蛋白酶（2.02.0）没有活性，）没有活性，而胰蛋白酶而胰蛋白酶(7.2(7.2-8.4)8.4)的活性较高。的活性较高。5.5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用 1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞 3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.培养正常或各种病变的细胞，培养正常或各种病变的细胞，用于细用于细胞的生理、药理、病理研究胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较 比较项目比较项目 植物组织培养植物组织培养 动物细胞培养动物细胞培养 原理原理 细胞的全能性细胞的全能性 细胞增殖细胞增殖 培养基性质培养基性质 固体培养基固体培养基 液体培养基液体培养基 培养基特有成分培养基特有成分 蔗糖蔗糖 植物激素植物激素 葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清 培养结果培养结果 植物体植物体 细胞株、细胞系细胞株、细胞系 培养目的培养目的 快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株 获得细胞或细胞获得细胞或细胞分泌蛋白分泌蛋白 取材取材 植物幼嫩部分或植物幼嫩部分或花药花药 胚胎或幼龄动物胚胎或幼龄动物的器官或组织的器官或组织 其他条件其他条件 无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜条件条件 无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜条件条件 在动物细胞培养过程中，下列哪种在动物细胞培养过程中，下列哪种现象是不可能的（现象是不可能的（）A A细胞一直在细胞悬液中分裂生长细胞一直在细胞悬液中分裂生长 B B有少部分细胞可能在培养条件下有少部分细胞可能在培养条件下无限地传代下去无限地传代下去 C C有部分细胞核型会发生变化有部分细胞核型会发生变化 D.D.个别细胞会发生基因突变个别细胞会发生基因突变 A 既然动物既然动物体细胞核仍具有全能体细胞核仍具有全能性，性，为什么不能直接利用动物体细为什么不能直接利用动物体细胞培育动物体？胞培育动物体？利用利用动物体细胞核移植技术动物体细胞核移植技术 动物细胞的全能性会随着动物细胞的全能性会随着动物动物细胞分化程度的提高而逐渐受细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，到限制，分化潜能逐渐变弱。分化潜能逐渐变弱。怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？1.1.定义：定义：3.分类：分类：2.原理：原理：二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞的一个细胞的细胞核细胞核，移入一个已经，移入一个已经去掉细胞核的卵母细去掉细胞核的卵母细胞中胞中。使其重组并发育成一个。使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎，这，这个新的胚胎最终发育为个新的胚胎最终发育为动物个体。动物个体。用核移植的方法得到的用核移植的方法得到的动物称为克隆动物动物称为克隆动物 动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性 胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植、体细胞核移植体细胞核移植 胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对能性相对容易容易 动物体细胞分化动物体细胞分化程度高，恢复其程度高，恢复其全能性十分全能性十分困难困难 4.4.体细胞核移植的过程体细胞核移植的过程 供体：优质高产奶牛供体：优质高产奶牛 为何取为何取供体细供体细胞胞传代培养传代培养1010代代以内的细胞？以内的细胞？1010代以内