动物细胞融合.ppt

19571957年，日本科学家岗田善雄在培养动年，日本科学家岗田善雄在培养动物细胞时加入失去活性的物细胞时加入失去活性的仙台病毒仙台病毒，发，发现了细胞融合、产生具有两个核的细胞。现了细胞融合、产生具有两个核的细胞。后来人们用此方法又成功地诱导了不同后来人们用此方法又成功地诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活，动物细胞融合技术随之诞胞培养成活，动物细胞融合技术随之诞生。现在这项技术已经广泛应用于细胞生。现在这项技术已经广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学科的研究工作中。科的研究工作中。细胞细胞A 细胞细胞B 杂种细胞杂种细胞 灭活的病毒灭活的病毒 物理法物理法 化学法化学法 仙台病毒仙台病毒 疱疹病毒疱疹病毒 新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒 概念：概念：通过诱导两个或多个细胞合并成一个双核或通过诱导两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）。如果）。如果2个不同的细胞进行融合，则称为细胞杂交（个不同的细胞进行融合，则称为细胞杂交（cell hybridization）融合细胞的类型：融合细胞的类型：同核体（同核体（homokaryon）：由同一生物：由同一生物个体的细胞（基因型相同）所融合形成个体的细胞（基因型相同）所融合形成的融合细胞。的融合细胞。异核体（异核体（heterokaryon）：）：来自不同基来自不同基因型的细胞所融合形成的杂交细胞。因型的细胞所融合形成的杂交细胞。1.生物方法（病毒）生物方法（病毒）病毒是最早采用的融合剂。某些病毒被膜中有病毒是最早采用的融合剂。某些病毒被膜中有融合蛋白融合蛋白（fusion protein），），可介导病毒同宿可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等。用作融合剂的病新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等。用作融合剂的病毒必须事先毒必须事先灭活灭活（紫外线或（紫外线或-丙内酯），使病毒丙内酯），使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。第二节第二节 诱导细胞融合的方法诱导细胞融合的方法 用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 仙台病毒是最常用的病毒诱导融合剂。仙台病毒是最常用的病毒诱导融合剂。优点：优点：融合率较高、应用广（对各种动融合率较高、应用广（对各种动物细胞都适宜）、容易培养（可在鸡胚物细胞都适宜）、容易培养（可在鸡胚中大量繁殖）。中大量繁殖）。病毒介导融合的缺点：病毒介导融合的缺点：不稳定，在保存过程中融合活性会降不稳定，在保存过程中融合活性会降低；制备过程比较烦琐。此外，病毒引低；制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。生干扰。2.2.化学诱导融合化学诱导融合 化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇其中最常用的是聚乙二醇（PEGPEG）。）。PEGPEG可以促使细胞凝结、破坏互相接触处可以促使细胞凝结、破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。形成一个大的双核或多核融合细胞。影响影响PEGPEG诱导融合效果的因素：诱导融合效果的因素：1.分子量与浓度：分子大、浓度高的分子量与浓度：分子大、浓度高的PEG，有利于融合，但毒性也随之增大。一般用有利于融合，但毒性也随之增大。一般用分子量分子量PEG 1000-4000，40%-60%2.PH:8.0-8.2 3.诱导时间：长，效率高，但毒性增大、容诱导时间：长，效率高，但毒性增大、容易形成多核细胞易形成多核细胞 4.温度：温度：38-40度度 3.3.物理方法物理方法(离心，震动，电融合离心，震动，电融合)最常用的是电融合法最常用的是电融合法 细胞在电场中排列成串、聚集成串珠状，细胞在电场中排列成串、聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，促使细胞在相互接触的然后施加高压电脉冲，促使细胞在相互接触的细胞膜处产生穿孔，导致细胞之间的细胞质连细胞膜处产生穿孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。通，进而发生细胞融合。细胞电融合技术有许多优点，如细胞电融合技术有许多优点，如诱导细胞诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。可重复性好。两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，如：类型细胞，如：1)1)亲本细胞亲本细胞 2)2)同核体：同源细胞的融合体同核体：同源细胞的融合体 3)3)异核体：非同源的细胞的融合体异核体：非同源的细胞的融合体 4)4)多核体：含有双亲不同比例核物质多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体的融合体 筛选的目的是为了获得优良的杂种细胞筛选的目的是为了获得优良的杂种细胞 第三节第三节 杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选 融合细胞的筛选方法融合细胞的筛选方法 1.1.利用细胞形态、大小、颜色差异筛选利用细胞形态、大小、颜色差异筛选 2.2.利用抗药性筛选利用抗药性筛选 亲本亲本A A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感敏感 亲本亲本B B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长上生长 3.3.利用营养互补筛选：利用营养互补筛选：细胞在缺乏一种细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本亲本A A：色氨酸缺陷型色氨酸缺陷型 亲本亲本B B：苏氨酸缺陷型苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。4.利用基因缺陷互补筛选利用基因缺陷互补筛选 最常用的是在亲本细胞的嘧啶和嘌呤代谢最常用的是在亲本细胞的嘧啶和嘌呤代谢途径中引入途径中引入缺陷突变缺陷突变来筛选杂交细胞，即来筛选杂交细胞，即HAT筛选系统。筛选系统。细胞合成核苷酸有细胞合成核苷酸有2条途径：从头合成途径和条途径：从头合成途径和补救途径。补救途径。阻断从头合成核苷酸阻断从头合成核苷酸途径的物质：途径的物质：次黄嘌呤次黄嘌呤(hypoxantin，H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(aminopterin，A)和胸和胸腺嘧啶脱氧核苷腺嘧啶脱氧核苷(thymidin，T)。HAT培养基：培养基：含有含有H、A、T的培养基的培养基 在在HATHAT培养基上，细胞从头合成培养基上，细胞从头合成核苷酸核苷酸途途径被阻断，只能利用补救合成途径。径被阻断，只能利用补救合成途径。在补救途径中，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖在补救途径中，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（转移酶（简称简称HGPRTHGPRT）和胸苷酸激酶）和胸苷酸激酶（TKTK）起起重要作用。重要作用。HGPRTHGPRT-和和TKTK-的细胞不能增殖，的细胞不能增殖，但但HGPRTHGPRT-TKTK+与与HGPRTHGPRT+-TKTK-融合细胞融合细胞则可以增殖。则可以增殖。鼠 人 X TK-HGPRT+TK+HGPRT-鼠 人 鼠 人 鼠 人 TK+和HGPRT+HAT HAT HAT 不分裂 不分裂 分裂 HAT筛选示意图 第四节第四节 融合细胞的克隆化培养融合细胞的克隆化培养 筛选出来的融合细胞仍属于异质性的筛选出来的融合细胞仍属于异质性的细胞群，不完全是纯系，需要进一步纯细胞群，不完全是纯系，需要进一步纯化、获得同质性的细胞群。常用方法是化、获得同质性的细胞群。常用方法是克隆化培养。克隆化培养。克隆化培养：克隆化培养：培养单个杂交细胞、以得培养单个杂交细胞、以得到遗传特征相同而稳定的杂种细胞系。到遗传特征相同而稳定的杂种细胞系。1.1.半固体培养法半固体培养法=平板培养平板培养 单细胞在软琼脂（或者琼脂糖）培养单细胞在软琼脂（或者琼脂糖）培养基上增殖后不能移动，形成集落。待细基上增殖后不能移动，形成集落。待细胞集落长到肉眼可见后，用吸管从琼脂胞集落长到肉眼可见后，用吸管从琼脂上挑出来上挑出来(一般一般8 8-1010天后天后)，再移到液体，再移到液体培养基中，进行繁殖。培养基中，进行繁殖。2.2.有限稀释法有限稀释法 将细胞稀释到将细胞稀释到100100个个/ml/ml，理论上每，理论上每0.01ml(100.01ml(10l)含有含有1 1个细胞。取个细胞。取0.01ml0.01ml细胞液在培养板细胞液在培养板(如如9696孔板孔板)的小孔中培养，则可获得单个细胞形成的集落。的小孔中培养，则可获得单个细胞形成的集落。1)1)取取1.0 ml 51.0 ml 510104 4/ml/ml细胞细胞+4ml+4ml培养基稀释，得培养基稀释，得 1 110104 4/ml./ml.2)2)取取0.5ml 10.5ml 110104 4/ml/ml细胞液细胞液+4.5ml+4.5ml培养基稀释，培养基稀释，得得1 110103 3/ml./ml.3)3)取取0.5ml10.5ml110103 3/ml/ml细胞液细胞液+4.5ml+4.5ml培养基稀释，得培养基稀释，得100 cells/ml.100 cells/ml.4)4)取取0.01ml0.01ml的的 100 cells/ml100 cells/ml细胞液于培养板小孔，细胞液于培养板小孔，加加0.1 ml0.1 ml培养基，培养后得杂种细胞系。培养基，培养后得杂种细胞系。3.3.显微镜操作法显微镜操作法 通过显微操作分离杂交单细胞、分别单独培养。通过显微操作分离杂交单细胞、分别单独培养。4.4.盖片分离法盖片分离法 1)1)用钉锤于洁净的橡胶上砸干净盖玻片；用钉锤于洁净的橡胶上砸干净盖玻片；2)2)选择碎块、大小形态适用碎片；选择碎块、大小形态适用碎片；3)3)加培养液、进行细胞培养；加培养液、进行细胞培养；4)4)倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片；倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片；5)5)进行单个细胞培养。进行单个细胞培养。5.5.荧光激活分离法荧光激活分离法 用一种荧光激活细胞分类器（用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS）分离杂交细胞。）分离杂交细胞。原理：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个原理：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在激发光的激发下，荧光素发射荧细胞的线形液滴，在激发光的激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。不同容器中。第五节第五节 细胞融合技术的应用细胞融合技术的应用 动物体受抗原刺激后可产生抗体，抑制抗原的作用；动物体受抗原刺激后可产生抗体，抑制抗原的作用；增加身体的抗体就可以提高机体的抗病能力。增加身体的抗体就可以提高机体的