染色质免疫共沉淀PPT.pptx

染色质免疫共沉淀(ChIP)目录 一、简介 DNA与蛋白质相互作用研究 DNase 足纹法 电泳迁移率变动分析 生物信息学方法 酵母单杂交系统 ChIP 一、简介 ChIP 是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。二、原理 在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。三、技术流程 具体操作流程 DNADNA分析分析 1、甲醛交联细胞 具 体 步 骤 10 ml1PBS 弃上清 4-5ml预冷1 PBS 预冷1PBS 洗涤两次 转移 4000rpm 离心5min 弃上清 1ml预冷1PBS 悬浮 新离心管 4000rpm离心5min 1ml1.25mol/L甘氨酸 室温10-20min 2、染色质超声断裂 1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min.每1min颠倒摇动一次离心管。2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰上。不同样本都进行超声条件优化实验。3.14000rpm离心10min（4），转移上清于1.5ml离心管。3.免疫沉淀蛋白和DNA复合物 超声染色质液体 2ml超声稀释液 4摇床摇动一小时 1000rmp离心2min（4）转移上清液至新离心管 ChIP稀释液稀释10倍 加入20 l蛋白A/G琼脂糖珠 1-4 l免疫沉淀抗体 取50 l上清液作为对照？4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA）样品 摇动1-2h，4 40 lProtein A/G Agarose Beads 1PBS洗3次离心1000rpm,1min.弃上清，用4 l 1PBS悬浮 1000rpm,离心5min,4 a 低盐洗脱溶液1ml洗一次 b 高盐洗脱溶液1ml洗一次 c氯化锂洗脱溶液1ml洗一次 d TE溶液(pH8.0)1ml洗两次 每次洗时，在摇床上摇10min,4，4000rpm离心5min 弃上清 5、洗脱免疫复合物 Beads 200 lChIP洗脱溶液洗脱 摇床上摇动10min 12000rpm离心1min 取上清 Beads 取上清 200 l,ChIP洗脱溶液(3次)600 l洗脱液 6、去除甲醛交联 加5mlNaCl使用NaCl终浓度为0.2mol/l 阴性对照+350lChIP洗脱溶液+16l 5mol/l NaCl。65,过夜,去交联。7、DNA纯化 酚/氯仿抽提 实验样本实验样本(600(600 l)l)5050 l l阴性阴性对照对照 10 lRNase 50l蛋白酶K 等量酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）12000rmp离心5min 上清液上清液 上清液上清液 1/10体积3mol/l乙酸钠 2倍体积冰冻无水乙醇 -80冰箱1h.12000rmp离心20min，弃上清 加入70%乙醇，悬浮沉淀，12000rpm离心10min，去上清，DNA干燥后，40lTE溶解 硅胶柱纯化 8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定(1)如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列是目的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定量PCR方法。(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用ChIP克隆测序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法。四、应用 组蛋白修饰研究 转录调控分析 药物开发研究 有丝分裂研究 DNA损伤与凋亡分析 五、优缺点 优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得；为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因获取可能需要限制在组织来源。