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关于研究蛋白质细胞定位的几种方法关于研究蛋白质细胞定位的几种方法 姓名：甄萍萍姓名：甄萍萍 导师：梁建生导师：梁建生 导言导言 真核细胞具有复杂的亚细胞结构，已发现数十种细胞器，每种细胞器都有一组特定的蛋白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合成，最终运送到不同地点，形成成熟蛋白并行使功能。转译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白在胞内定位。蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。目前，这方面的工作己取得很人进展。细胞器不同，相应的靶向蛋白的定位过程也不同。研究蛋白亚细胞定位主要的几种方法研究蛋白亚细胞定位主要的几种方法 免疫荧光技术免疫荧光技术 免疫胶体金标记免疫胶体金标记 与与gfp构建融合基因，用荧光显微镜观察构建融合基因，用荧光显微镜观察 免疫荧光技术免疫荧光技术 根据抗原与抗体反应得原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原或抗体复合物上含有各种颜色的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激光的照射而发出各种颜色的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。S.pagny等(2003)将XYIT36:GFP转入拟南芥，检测发现荧光出现在高尔基体。使用植物Lewis(高尔基体标志分子)抗体以及BIP(内质网标志分子)抗体进行免疫荧光标记，发现GFP的绿色荧光与使用Lewis抗体所做的免疫荧光存在共定位，而与BIP分布在不同部位。说明XYIT36:GFP定位在高尔基体。免疫胶体金标记免疫胶体金标记 金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。免疫胶体金标记电镜技术广泛应用于细胞及组织内蛋白的定位研究，金标法是利用胶体金在碱性环境中带负电的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。电镜水平的免疫金染色是目前较理想的免疫定位方法，具有特异性强、灵敏度高、定位准确和具有双重标记功能等优点。例如用连有15nm金颗粒的GFP单克隆抗体以及连有lOnm金颗粒的过氧物酶体的标志酶抗体作为一抗进行免役金标，证明CAT1-GFP定位在过氧物酶体(Akane Kamigaki eta1.,2003)。GFP及其在生命科学研究中的应用 简介GFP 海洋生物发光是个非常普遍的现象。从原生生物到脊椎动物均有生物发光，如海萤，磷虾，腔肠动物等。从不同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同，不同动物荧光发生机制有很大差别。多管水母体内存在两种发光蛋白绿色荧光蛋白:GFP和aequorin。当aequorin与3个Ca2+结合后，即发生氧化反应并发射蓝光，最大发射波长469nm。GFP被紫外光或蓝光激发后发出绿色荧光(Morise,H.，Shimomura,1974)。GFP在水母体内的发光机制如下：GFP荧光的产生主要归功于分子内第65,66,67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。翻译出的蛋白折叠环化后，在O2存在下分子内第67位甘氨酸的酰基对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的。a-键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团，该过程可自动催化合成(Heim R,Douglas CP.,1994)GFP晶体结构(如图)显示：蛋白中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm,宽240nm，由11个围绕中心a螺旋的反平行 折叠组成，荧光基团的形成是从这个螺旋开始，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由1个短的垂直片段覆盖，生色团位于大空腔内(CubittAB,1999)。GFPGFP在生命科学研究中的应用在生命科学研究中的应用 GFP虽能自发荧光，但野生型GFP荧光较弱。为了改善GFP荧光特性，对GFP进行了突变和重组实验。Pang等获得的GFP突变型比野生型亮度增强20倍;Tian等发现野生型GFP是低水平表达，而改良后的GFP表达量增加100倍。Cormack等获得的三位点替代突变体的荧光强度比野生型高100倍，而且在自然光下就能观察到绿色荧光，使得gfp作为报告基因更为灵敏和迅速。Confocal能有效消除同一焦平面上非检测点的杂散荧光和非焦平面荧光的干扰，使分辨率提高，获得清晰图象，而且它具有逐层扫描功能，可对组织细胞进行无损伤的系列光学切片。Confocal的应用更有利于GFP在生物学研究中的应用。原理原理 应用DNA亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化合适的细胞，利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信号序列来控制融合基因的表达，在荧光显微观察系统下监测融合蛋白在细胞内的存在状态。目的基因目的基因 融融合基因合基因 gfp 转化转化 表达表达 荧光显微观察荧光显微观察 细胞器研究细胞器研究 在植物发育过程中可以利用GFP直接观察生活细胞中线粒体的数目、分配和运动。将GFP与某一导肽序列融合可将GFP定位到特定的细胞器和膜系统中，然后对其进行活体观察来研究不同细胞器的动态、功能以及内膜系统。如将GFP和内质网定位信号KDEL构建成融合蛋白，结果在转化细胞的内质网中观察到膜皮层样的网状结构(Scotta,Wyatts,1999)。此标记物也促进了内膜系统结构、功能和囊泡运输的研究。还可用GFP的光谱突变体如蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白来研究不同植物细胞骨架组分之间的相互作用，在动物和酵母中，GFP与肌动蛋白、微管蛋白以及其他细胞骨架作用蛋白融合，成功的研究了细胞骨架力学(Westphal et al.,1997;Schafer et al.,1998;Smith 2003)。蛋白质研究蛋白质研究 将GFP作为荧光探针，与要研究的蛋白质融合在一起，进行活细胞内蛋白质的分布与变化研究。此方法在过去几年中对细胞生物学的观察有着显著影响。水稻的CaM类蛋白OsCaM61，含有N一端CaM区域，C端有异戊二烯化位点。将OsCaM61与GFP融合起来，研究其亚细胞定位，发现GFP-OsCaM61融合蛋白是膜结合的，而OsCaM61-GFP却主要在核质。用mevinolin处理细胞，阻止类异戊二烯合成，引起GFP-OsCaM61运输到核质。前者C端的异戊二烯化位点被掩盖而后者的位点是活跃的。此蛋白的异戊二烯化状态对于细胞定位起决定性作用。亚细胞定位依赖于蛋白的异戊二烯化状态，表明在不同的生理条件下，这种类CaM可能通过结合到定位于不同细胞成分的靶子上，起到不同的功能作用(Aiwa Dong et a1.,2002)A、B:仅转入仅转入GFP C、D:转入转入PF40-GFP融合蛋白融合蛋白 用GFP还可以用于基因沉默、启动子活性、细胞信号转导和细胞局部区域的pH、内生菌和植物相互作用研究等。GFP在动物学研究方面的应用也非常广泛(比如用于研究肿瘤发生机制、转移机制、基因治疗等)。gfp用作报告基因有众多优点：1灵敏度高，易检测并且是活体检测，对细胞组织不具破坏性。而当选用gus作报告基因时，在组织学检测时，一定程度上具有破坏性。因为要对材料进行固定，保温和脱色，并且植物中存在GUS本底，影响检测的准确性；2在活体内表达不受生物类型、基因型、细胞和组织类型的限制；3不需任何底物和外源辅因子参与；4便于早期筛选转基因材料。GFP在生物学研究中应用广泛，有很大优越性，但也存在一定的问题。GFP的检测受背景荧光和光漂白现象的限制，它的过量表达对细胞是有毒的，转化细胞再生能力下降。实验中很难建成GFP稳定细胞株，可能与GFP参与细胞凋亡有关。参考文献：1.Akane Kamigaki.Identification of peroxisomal targeting signal of pumpkin catalase and the binding analysis with PTS1 receotor.Plant Journa1.2003,33:161-175 2.Scott A,Wyatt S,TsouP L,et al.Model system for plant cell biology;GFP imaging in living onion epidermal cells.Biotechniques,1999,26:1125-1132 3.S.Pagny.Structural reguirements for Arabidopsis f31,2-xylosyltransferase activity and targeting to the Golgi.Plant Journal,2003,33:189-203 4.王关林，方宏绮.植物基因工程原理与技术.北京:科学出版社，1998.