免疫细胞的分离及其表面标志检测技术.ppt

第三章第三章 免疫细胞的分离及其免疫细胞的分离及其表面标志检测技术表面标志检测技术 第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 一一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 二二、淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 三三、T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 四四、T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离 第二节第二节 淋巴细胞标志及亚群分类淋巴细胞标志及亚群分类 一一、细胞表面标志及亚群细胞表面标志及亚群 二二、B B细胞表面标志细胞表面标志 三三、NKNK细胞表面标志细胞表面标志 第三节第三节 其他的免疫细胞其他的免疫细胞 第四节第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测及应用 一一、免疫细胞表面标志的检测方法免疫细胞表面标志的检测方法 二二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测的临床意义 思考题思考题 小结小结 第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离 一、外周血单个核细胞分离一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells,PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。）。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。细胞分离基本原理细胞分离基本原理 不同细胞密度不同不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同 不同细胞密度不同不同细胞密度不同 人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 不同细胞密度不同不同细胞密度不同 用用1.0771.0770.0010.001的分层液可将细胞分离的分层液可将细胞分离 密度梯度离心密度梯度离心(Ficoll)(Ficoll)离心离心 二二、淋巴细胞分离、淋巴细胞分离 贴壁粘附法贴壁粘附法 吸附柱过滤法吸附柱过滤法 磁铁吸引法磁铁吸引法 Percoll Percoll 分离液法分离液法 （连续密度梯度离心）（连续密度梯度离心）（去单核细胞）（去单核细胞）E E花环沉降法花环沉降法 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法 三、三、T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 四、四、T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离 亲和板结合分离法亲和板结合分离法 磁性微球分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 磁珠大小可以选择磁珠大小可以选择 大小免疫磁珠分离细胞的特点比较大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 比较项目比较项目 大磁珠大磁珠 小磁珠小磁珠 对细胞的影响对细胞的影响 对细胞造成机械压力对细胞造成机械压力，影响影响其生物学活性其生物学活性，不利于分离不利于分离后培养后培养。对细胞温和对细胞温和，不影响分离细不影响分离细胞的后续培养胞的后续培养。对流式细胞仪的影响对流式细胞仪的影响 阻塞流式细胞仪的喷嘴阻塞流式细胞仪的喷嘴，影影响散射光响散射光。可直接上流式细胞仪检测可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光不影响散射光。分离条件要求分离条件要求 技术简单技术简单，分离可在试管中分离可在试管中完成完成。需要很强的磁场来分离细胞需要很强的磁场来分离细胞。收率收率 得率高得率高。得率不高得率不高。纯度纯度 纯度低纯度低。纯度高纯度高。分离时间分离时间 分离速度快分离速度快。分离速度慢分离速度慢。分离成本分离成本 成本低成本低。需要很强的磁场来分离细胞需要很强的磁场来分离细胞，需要一次性的分离柱需要一次性的分离柱，不能不能在普通试管进行在普通试管进行。免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程 免免 疫疫 磁磁 珠珠 细细 胞胞 分分 选选 装装 置置 全自动细胞分选系统全自动细胞分选系统 流式细胞分析仪流式细胞分析仪 第二节第二节 淋巴细胞标志及亚群分类淋巴细胞标志及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（志是簇分化抗原（Cluster of Cluster of differentiationdifferentiation，CDCD）。）。细胞表面分化抗原（细胞表面分化抗原（CDCD抗原抗原）适用于适用于T T、B B细胞的分离细胞的分离 已知已知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离 未知未知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离 （阴性分选）（阴性分选）一、一、T T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性辅助性T细胞细胞 （help T cell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性细胞毒性T细胞细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）CD4+CD25+调节性调节性T细胞细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）二、二、B B细胞表面标志细胞表面标志 SmIgSmIg、FcFc受体、补体受体、受体、补体受体、EBEB病毒受体，部分病毒受体，部分CDCD分子是分子是B B细胞的重要表面标志，其中以细胞的重要表面标志，其中以SmIgSmIg为为B B细胞所特有，是鉴定细胞所特有，是鉴定B B细胞可靠的指标。细胞可靠的指标。CD19/CD5CD19/CD5分子：可将分子：可将B B细胞区分为细胞区分为B1B1细胞和细胞和B2B2细胞，细胞，B1B1细胞为细胞为CD19CD19和和CD5CD5双阳性，而双阳性，而B2B2细胞细胞仅为仅为CD19CD19阳性，阳性，B2B2细胞为通常所指的细胞为通常所指的B B细胞细胞。三、三、NKNK细胞表面标志细胞表面标志 人类人类NK细胞表面标志主要以细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为淋巴细胞认定为NK细胞。细胞。T细胞及细胞及NK细胞细胞 第三节第三节 其他的免疫细胞其他的免疫细胞 抗原提呈类细胞表面标志抗原提呈类细胞表面标志 第四节第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测及应用 免疫细胞表面标志的检测方法免疫细胞表面标志的检测方法 淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测的临床意义 一、免疫细胞表面标志的检测一、免疫细胞表面标志的检测 抗体致敏细胞花环法抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法免疫细胞化学法 免疫荧光法免疫荧光法 流式细胞分析法流式细胞分析法 二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。能的重要指标。对对CD4+CD4+和和CD8+TCD8+T细胞的测定，有助于免细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。排斥反应的监测。临床常见疾病中的临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化 思考题思考题 1 1.免疫细胞都包括哪些细胞免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分离为什么要将其分离纯化纯化？2 2.淋巴细胞有哪几类细胞淋巴细胞有哪几类细胞？能用形态学的方法加能用形态学的方法加以区别吗以区别吗？3 3.将细胞分离的原理有哪些将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点各有什么特点？4 4.形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？5 5.T T细胞和细胞和B B细胞进一步区分亚群的依据是什么细胞进一步区分亚群的依据是什么？6 6.什么是细胞表面标志什么是细胞表面标志？其作用是什么其作用是什么？7 7.细胞表面标志的检测方法有哪些细胞表面标志的检测方法有哪些？8 8.利用细胞表面标志利用细胞表面标志（CDCD抗原抗原）分离细胞的方法分离细胞的方法有哪几种有哪几种？9 9.T T细胞细胞、B B细胞细胞、NKNK细胞细胞、单核细胞的主要生物单核细胞的主要生物标志是什么标志是什么？1010.淋巴细胞表面标志检测的临床意义是什么淋巴细胞表面标志检测的临床意义是什么？小小 结结 淋巴细胞并不是功能单一的群体淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其但其在光学显微镜下的形态基本是一样的在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法不能采用形态学的方法，而要依靠对其而要依靠对其表面标志的检测表面标志的检测。常用于鉴定和检测计常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是数淋巴细胞的表面标志是CDCD抗原抗原。进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前但目前看来看来，还很少有只通过一个还很少有只通过一个CDCD抗原就能抗原就能将某一类淋巴细胞亚群指示出来的将某一类淋巴细胞亚群指示出来的CDCD抗抗原原，CDCD抗原指示出来的淋巴细胞亚群多抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特异数都是相对特异。根据根据T T细胞的免疫效应功能和表面细胞的免疫效应功能和表面CDCD分子分子表达至少可以分为：辅助性表达至少可以分为：辅助性T T细胞细胞、细胞细胞毒性毒性T T细胞和调节性细胞和调节性T T细胞；细胞；SmIgSmIg为为B B细胞细胞所特有所特有，是鉴定是鉴定B B细胞可靠的指标细胞可靠的指标，以以CDCD5 5和和CDCD1919为标志可将为标志可将B B细胞分为细胞分为B B1 1和和B B2 2两个亚群；目前多以两个亚群；目前多以CDCD3 3-、CDCD1616+、CDCD5656+作为作为NKNK细胞的典型标志细胞的典型标志。