乳铁蛋白.ppt

乳铁蛋白乳铁蛋白 乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。乳铁蛋白乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf)是一个大约有700个氨基酸残基构成的、分子量约为80KDa的单体糖蛋白，属于转铁蛋白家族，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌。因其晶体呈红色，故也有学者称之为“红蛋白”。定义定义 乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中（包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞，人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/ml，是牛乳中的10倍（牛乳中含量为0.02-0.35mg/ml），占普通母乳总蛋白的20%。分分 布布 血液中乳铁蛋 白主要来自中性白细胞，骨髓、子宫内膜及胎盘等也能分泌少量的乳铁蛋白进入血液。人在泌乳期间，乳铁蛋白含量随着泌乳时间的不同而发生变化，如人初乳中乳铁蛋白可达6-14mg/ml，常乳期降至1mg/ml。乳铁蛋白由700个左右的氨基酸组成。人乳铁蛋白分子量为82.4KDa，有692个氨基酸残基；牛乳铁蛋白分子量为83.1KDa，由689个氨基酸组成。乳铁蛋 白 N 端(1 338)与 C 端(339 692)两个球状结构相应位置上有 37(125 个)的氨基酸完全相同。结构及性质结构及性质 人乳铁蛋白与牛乳铁蛋白结构相似，氨基酸残基组成单链，两端折叠成球形(N叶和 C 叶)，中间由一段螺旋肽链连接呈现“二枚银杏叶型”结构。在晶体结构中Phe17Leu29间肽链形成-螺旋结构，Ser33Arg39间无规则卷 曲结构并使一个平行 -折叠结构与N 端相连。Phe17 Leu29间肽段具有较强 的抗菌活性，如果将其a-螺旋变成-折叠结构抗菌活性有较大提高，可能是由于 -折叠结构易于细菌表面接触的缘故。每个分子中有2个金属结合位点，每个位点可结合一个Fe3+和 一 个HCO3-或 CO32-乳铁蛋白对胰蛋白酶类具有很强的抗降解能力，尤其是结合铁离子后抗降解能力增强，因此在肠道内不易被降解，能以完整分子的形式被吸收。这种抗蛋白酶水解的特性可能与糖基化有关。在铁离子结合结构域中包括三个阴离子配子体(两个酪氨酸残基，一个天冬氨酸残基)和一个组氨酸残基，可与铁离子形成稳定的结合。在酸性条件下对热稳定;在碱性条件下,高于80即开始凝胶化。根据Lf结合Fe的多寡，可将其分为缺铁型乳铁蛋白(apoLf)、铁半饱和型乳铁蛋白和 铁饱和型乳铁蛋白(Holoix)三种形式。不同形式的Lf具有不同的抗变性能力，其抗巴 氏杀菌热变性能力依次为：Holoix 铁半饱和型乳铁蛋白 apoLf。牛乳Lf的等电点pH值为8.2左右，人Lf的等电点为6左右。1、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白具白具 有有 广广 谱谱 抗抗 菌菌 作作 用用 Lf抑菌效果取决于微生物对铁的需求程度、外源铁的生物利用率、Lf的铁饱和度、盐类、pH值、抗体或其他免疫物质、介质等。生物学功能生物学功能 首 先，Lf 对 革 兰 氏 阴 性 菌 和 阳 性 菌 的 抑 菌 作 用 是 由于 乳 铁 蛋 白 高 度 结 合 铁，使 细 菌 失 去 生 长 所 需 的 基本 元 素 铁；其 次，L f 通 过 氨 基 末 端 强 阳 离 子 结 合 区域，增 加 细 菌 细 胞 膜 的 通 透 性，使 细 菌 的 脂 多 糖 从外 膜 渗 出，达 到 直 接 杀 菌 作 用；另 外，Lf 可 通 过水 解 得 到 的 抗 菌 肽 来 实 现 抗 菌 作 用。将 Lf 通 过蛋 白 酶 水 解 获 得 一 些 低 分 子 量 的 肽，这 些 肽 的 抗 菌活 性 大 幅 度 增 强，可 抑 制 G+和 G-菌 生 长，其 中 包括 一 些 对 Lf 具 有 抵 抗 性 的 菌 株。目 前 认 为 Lf 的 抗 菌 机 理 可 能 有 以 下 3 个 方 面：2、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 具具 有有 抗抗 病病 毒毒 作作 用用 天 然 的 Lf 能 够 抑 制 人 免 疫 缺 陷 病 毒 和 巨 细 胞 病 毒 对 M T4 细 胞 和 成 纤 维 细 胞 的 病 变 作 用，此 外，还 具 有 抑 制 流 感 病 毒 的 活 性，主 要 是 因 为 其 碳 水 化 合 物 残 基 上 含 唾 液 酸，它 干 扰 病 毒 对 靶 细 胞 的 结 合 和 侵 染。乳 铁 蛋 白 通 过 抑 制 病 毒 进 入 细 胞，减 轻 对 人 体 肝 细 胞 的 损 害。3、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 具具 有有 抗抗 氧氧 化化 作作 用用 研 究 结 果 显 示，乳 铁 蛋 白 能 抑 制 铁 诱 导 的 脂 质 过 氧 化 过 程 所 产 生 的 硫 代 巴 比 妥 酸 和 丙 二 醛 的 生成。另 外，牛 乳 铁 蛋 白 能 降 解 酵 母 中 的 tR N A，具 有 核 糖 核 酸 酶 的 活 性，且 能 抑 制 超 氧 离 子 的 形 成。所有 这 些 都 可 降 低 人 体 内 自 由 基 对 动 脉 血 管 壁 弹 性 蛋 白 的 破 坏，达 到 预 防 和 治 疗 动 脉 粥 样 硬 化 和 冠 心 病 的 目 的 4、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白具白具 有有 抗抗 癌癌 作作 用用 乳 铁 蛋 白 对 消 化 道 肿 瘤，如 结 肠 癌、胃 癌、肝 癌、胰 腺 癌，具 有 化 学 预 防 作 用，并 可 抑 制 由 此 引 发 的 肿 瘤 转 移。另 外，乳 铁 蛋 白 在 启 动 宿 主 防 御 系 统 的 初 始 活 化 反 应，调 控 不 同 类 型 淋 巴 细 胞 比 例 的 改 变 对 机 体 免 疫 反 应 的 影 响，提 高 免 疫 力 等 方 面 都 起 到 了 促 进 作 用。5、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 调调 节节 机机 体体 免免 疫疫 反反 应应 乳 铁 蛋 白 具 有 调 节 巨 噬 细 胞 活 性 和 刺 激 淋 巴 细 胞 合 成 的 能 力；而 且 嗜 中 性 粒 细 胞 是 含 乳 铁 蛋 白 最 多 的 细 胞，在 机 体 受 感 染 时 可 以 将 乳 铁 蛋 白 释 放 出 来，释 放 出 的 乳 铁 蛋 白 夺 取 致 病 菌 的 铁 离 子 致 使 后 者 死 亡。另 外，经 研 究 显 示，乳 铁 蛋 白 对 抗 体 生 成、T 细 胞 成 熟、淋 巴 细 胞 中 自 然 杀 伤 细 胞 比 例 都 具 有 调 节 作 用 6、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 调调 节节 胃胃 肠肠 道道 铁铁 的的 吸吸 收收 乳 铁 蛋 白 通 过 它 的 氨 基 和 羧 基 末 端 两 个 铁 结 合 区 域 能 高 亲 和 性 地，可 逆 地 与 铁 结 合，并 维 持 铁 元 素 在 一 个 较 广 的 p H 值 范 围 内 完 成 铁 在 十 二 指 肠 细 胞 的 吸 收 和 利 用。7、乳、乳 铁铁 蛋蛋 白白 同同 药药 物物 的的 协协 同同 作作 用用 研 究 显 示，乳 铁 蛋 白 能 同 多 种 抗 生 素 和 抗 病 毒 药 物 协 同 作 用，减 少 药 物 用 量，降 低 抗 生 素 或 抗 真 菌 制 剂 对 人 肝 。肾 功 能 的 损 害。同 时，增 强 体 内 微 生 物 对 药 物 的 敏 感 性。影影 响响 Lf Lf 功功 能能 的的 因因 素素 实验证明，婴儿或仔畜出生初期，Lf降解程度很低，随后迅速升高，生理功能也逐渐消失。Lf的抑菌作用具有很强的铁依赖性，只有在其处于不饱和状态时，才具有较强的抑菌能力，而在Lf呈铁饱和状态时，抑菌作用也不复存在。pH值也影响Lf的活性，在pH中性环境中，Lf活力较强，当pH 6 时，则基本无抑菌功能。盐的种类明显影响Lf的抑菌能力，碳酸盐可增强Lf的抑菌作用，而柠檬酸盐则会减弱 Lf的抑菌作用，肠液内存在 HC03一，因此有利于Lf发挥抑菌功能。此外，抗体或其他免疫物质也会影响Lf的抑菌能力，例如，Lf和初乳中的IgA、IgG就具有协同抑菌的作用。Lf只有在维持其活性不被降解的前提下，才能发挥生理功能。乳铁蛋白的生产制备方法乳铁蛋白的生产制备方法 牛初乳富含LF,可采用色谱法、超滤法、盐析法、酸沉淀法等方法从初乳中提取乳铁蛋白。牛初乳经冷冻离心机脱脂,35下加入适当稀释的皱胃酶液,分离去除酪蛋白.微滤后即为用于超滤研究的物料.用 MWCO为100000的超滤膜进行首次超滤,透过液再用MWCO为50000的超滤膜进行第二次超滤,然后用 MWCO为10000的超滤膜进行浓缩,冷冻干燥,即得到Lf 的粗品.超滤法超滤法：LfLf的分离纯化及检测方法的分离纯化及检测方法 目 前 鉴 定 乳 铁 蛋 白 的 方 法主 要 有：免 疫 双 扩 散 法、酶 联 免 疫 检 测 法(E L ISA),反相高效液相色谱法等 反相高效液相色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白含量反相高效液相色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白含量 色谱条件 色谱柱：Kromasil C4色谱柱（250mm*4.6mm,5m）。流动相：乙腈-水-三氟乙酸（80:20:0.1)流速0.6mL/min;检测波长:220nm,柱温：25；进样量10.0L 样品溶液的制备 量取新鲜牛初乳离心除脂肪，得到的脱脂乳调pH值至4.6，离心除酪蛋白，收集乳清，然后调pH值至6.8，加硫酸铵使饱和度达到40%，离心取乳清液，用截留分子量为300Ku、100Ku、30Ku的超滤膜包进行超滤，收集30Ku膜包超滤后的回留液进行离子交换层析，收集洗脱峰，即为样品溶液。精密称取乳铁蛋白标准品1mg,配制浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.05、0.025mg/mL的对照品溶液。乳铁蛋白进样量浓度在25-1000g/mL时，线性关系良好。取样品进行RP-HPLC检测。如图3所示为离子交换层析后收集各洗脱峰，其中峰1、2为未吸附蛋白流穿液，峰3为低盐浓度洗脱液，峰4为高盐浓度洗脱液，即提取的乳铁蛋白洗脱液。图4为峰4洗脱液经RP-HPLC检测结果。结果显示牛初乳经除脂肪、除酪蛋白、超滤和离子交换层析后，提取的乳铁蛋白的平均纯度为92.23%，RSD为1.3%。作为一种高效补铁组分，Lf可用作食品添加剂，以改变婴幼儿及孕妇普遍缺铁的现状，也可制成含铁饮料或补铁胶囊，用来提高造血功能，改善贫血。在食品或乳制品(如婴幼儿奶粉)甚至口香糖中，添加Lf可调节免疫功能。国外在乳制品中补充益生菌和Lf，制成片剂或速溶饮料，作为运动员的营养品。把Lf添加到碳酸饮料、焙烤食品中既具营养价值，又可增进消化功能。在肉食生产中，可利用 Lf抑制产品表面因人手接触等原因而滋生的有害细菌。在玉米油乳化体系及卵磷脂脂质体系中Lf具有抗氧化功能。实验证明，Lf可改进大豆油粉末的保质期。总之，Lf因其具有多种生理活性功能，在乳品、食品、生化、医药、化妆品等领域已得到广泛应用，其开发前景不可限量 乳铁蛋白的应用乳铁蛋白的应用 感谢您的关注！感谢您的关注！