乙肝疫苗的制备.ppt

基因工程基因工程 乙肝疫苗的制备乙肝疫苗的制备 演演 讲讲 者：者：鞠鞠 林林 PPT 制 作者：杨秀兰 李翠华 欧永银 资料提供者：鞠林鞠林 刘珍刘珍 王伟杰王伟杰 彭博彭博 周永斌周永斌 李凯李凯 向运新向运新 朱晓东朱晓东 基因工程 定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状并能稳定遗传。作用：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状。某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能.获得目的基因获得目的基因 表达载体表达载体 重组的表达载体重组的表达载体 酶切、连接酶切、连接 宿主细胞宿主细胞 转化、转染等转化、转染等 原核生物细胞原核生物细胞 植物植物细胞细胞 动物细胞动物细胞 卵细胞卵细胞 培养的动培养的动物细胞物细胞 转基因动转基因动物物 胚胎胚胎发育发育 药物、疫苗药物、疫苗 转基因植物转基因植物 转基因转基因微生物微生物 基因工基因工程药物程药物 人类细胞人类细胞 基因基因治疗治疗 蛋白质名称 用 途 促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone）治疗风湿（rheumatic disease）B细胞生长因子（B-cell growth factor）治疗免疫系统功能失调 降钙素(calcitonin)治疗软骨病(osteomalacia)集落刺激因子(colony stimulating factor)治疗血液病、肿瘤辅助治疗 绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin)治疗不排卵症 内啡肽和脑啡肽(endorphine and enkephalin)镇痛剂(analgesic agent)上皮生长因子(epidermal growth factor)促进伤口愈合 红细胞生成素(erythropoietin)治疗贫血(anemia)凝血因子(factor)治疗血友病(hemophilia)凝血因子(factor)治疗血友病 生长激素(growth hormone)促进生长 生长激素释放因子(growth hormone releasing factor)促进生长 胰岛素(insulin)治疗糖尿病(diabetes)干扰素(interferon)抗病毒抗肿瘤 白细胞介素(interleukin)治疗癌症 基因重组乙肝疫苗基因重组乙肝疫苗 用基因重组技术把乙型肝炎病毒的表面抗原用基因重组技术把乙型肝炎病毒的表面抗原（HbsAg）基因片段插入酵母细胞或哺乳动物）基因片段插入酵母细胞或哺乳动物细胞的基因中，在体外培养增殖过程中组装或细胞的基因中，在体外培养增殖过程中组装或分泌出乙型肝炎表面抗原，然后把表面抗原收分泌出乙型肝炎表面抗原，然后把表面抗原收集起来提纯之后做成乙型肝炎疫苗。集起来提纯之后做成乙型肝炎疫苗。乙肝疫苗的制备 产品 蛋白质的分离纯化 目的基因的表达 工程菌的构建 目的基因的获取 目的基因的获取 编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取 一般的目的基因的获取方法有：反转录法 化学合成法 反转录聚合酶链反应法 cDNA文库文库的建立？的建立？cDNA文库的建立文库的建立 Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA与载体的连接 重组体导入受体细胞 cDNA文库的鉴定 目的cDNA克隆的分离和鉴定 工程菌的构建 CHO细胞的特点 具有准确的转录后修饰功能,表达的糖基化药 物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子 具有产物胞外分泌功 能,便于下游产物分离纯化;具有重组基因的高效 扩增和表达能力;具有贴壁生长特性,且有较高的 耐受剪切力和渗透压能力,可以进行悬浮培养,表达 水平较高;CHO 细胞属于成纤维细胞(fibrob2last),很少分泌自身的内源蛋白,利于外源蛋白的后分离 材料 菌株质粒及细胞 大肠杆菌 DH5 和质粒 pMD18-Sm（携带改变稀 有密码子后的 S 基因）质粒 pCIneo CHO dhfr-细胞 pMD18-T 载体 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA ligase、质粒 DNA 提取 和柱式胶回收试剂盒 乙型肝炎表面抗原检测试剂盒 DMEM 和透析胎牛血清 胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体 Lipofectamine TM HBsAg 血凝检测试剂盒 目的基因的表达 蛋白质的分离纯化 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化 成品加工 浓缩与初步纯化 离子交换层析 疏水层析 亲和层析 固液分离 离心沉淀 膜过滤 双水相萃取 高度纯化 DNA的去除 热原质的去除 病毒的去除 分离纯化的基本要求 技术条件温和，保持其生物活性 选择性好，达到有效分离纯化的目的 技术间可以直接连接，节省工艺步骤 收率高，过程快 选择分离纯化方法的依据 根据产物表达形式来选择 根据分离单元之间的衔接来选择 根据分离纯化工艺的要求来选择 分离纯化工艺流程 HIC Butyl S Sepharose FF（疏水柱层析）IEC DEAE Sepharose FF（阴离子交换柱层析）GFC Sepharose 4 FF（凝胶过滤柱层析）1、发酵液的预处理 连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩 2、疏水柱层析 介质：Butyl S Sepharose FF 加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液电导率相等 按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析 3、阴离子交换柱层析 介质：DEAE Sepharose FF HBsAg活性蛋白经Sephadex G-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统的PH、离子强度和IEC平衡液一致 按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析 4、凝胶过滤柱层析 介质：Sepharose 4 FF 超滤浓缩到适当体积 按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析 5、除菌 收取到的HBsAg除菌过滤，即为纯品 谢谢观赏