乙肝表面抗原及乙肝两对半检测1.ppt

乙肝表面抗原及乙肝两对半检测 主要内容 检测方法及原理检测方法及原理 胶体金免疫层析法 酶免疫技术 免疫定量分析法 检测的方法及原理 检测方法及原理 胶体金免疫层析法胶体金免疫层析法 Part 1 胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。检测方法及原理 胶体金免疫层析法胶体金免疫层析法 Part 2 酶免疫技术 以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原抗体的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。酶结合物既保留抗体（或抗原）的免疫学活性，又保留酶对底物的催化活性。特点：灵敏度高、特异性强、准确性好、试剂稳定、方 法简便易行 检测方法及原理 Part 2 两对两对半半ELISAELISA检测检测原理原理 ELISAELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISAELISA双抗双抗体夹心法及体夹心法及ELISAELISA间接法。间接法。检测方法及原理 Part 2 两对两对半半ELISAELISA检测检测原理原理 1 HBsAg：双抗体夹心法 正比 单克隆HBsAbHBsAg多克隆HBsAbHRP 2 HBsAb：双抗原夹心法 正比 HBsAgHBsAbHBsAgHRP 检测原理 Part 2 两对两对半半ELISAELISA检测检测原理原理 3 HBeAg：双抗体夹心法 正比 单克隆HBeAbHBeAg多克隆HBeAbHRP 4 HBeAb：竞争抑制法 反比 多克隆HBeAbHBeAgHBeAbHRP/HBeAb（标本）5 HBcAb：竞争抑制法 反比 HBcAgHBcAbHRP/HBcAb（标本）检测方法及原理 Part 3 免疫定量分析方法免疫定量分析方法 近年来，随着抗病毒药物的不断问世，以及抗病毒药近年来，随着抗病毒药物的不断问世，以及抗病毒药物疗效与乙肝病毒及其血清标志物水平之间关系的相关物疗效与乙肝病毒及其血清标志物水平之间关系的相关研究不断深入，单纯研究不断深入，单纯HBsAgHBsAg定性检测在疗效的监测，特别定性检测在疗效的监测，特别是根据其早期变化对远期疗效进行预测方面，显得越来是根据其早期变化对远期疗效进行预测方面，显得越来越难以满足要求。而且，很多学者对一些新药上市注册越难以满足要求。而且，很多学者对一些新药上市注册临床试验结果进行分析发现，临床试验结果进行分析发现，HBsAgHBsAg的定量检测在抗病毒的定量检测在抗病毒治疗疗效的监测方面确有非常重要的意义。因此，治疗疗效的监测方面确有非常重要的意义。因此，HBsAgHBsAg的定量检测就显得十分重要。的定量检测就显得十分重要。检测方法及原理 Part 3 免疫定量分析方法免疫定量分析方法 要想完成要想完成HBsAgHBsAg定量检测，必须满足以下条件：定量检测，必须满足以下条件：采用自动分析系统，采用自动分析系统，有可溯源的标准品，有可溯源的标准品，测定结果与标准品之间有线性关系。测定结果与标准品之间有线性关系。检测方法及原理 Part 3 免疫定量分析方法免疫定量分析方法 化学发光技术是近二十年来发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。化学发光免疫测定（Chemiluminesent Immunoassay，CLIA）是免疫测定技术继酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）之后发展的一项新兴测定技术。由于这种测定具备很高的特异性和很小的干扰，因此，如同RIA、FIA等一样利用免疫反应的特异性和化学发光本身的信号特异性形成了目前所说的化学发光免疫测定（CLIA）技术。检测方法及原理 Part 3 免疫定量分析方法免疫定量分析方法 原理：化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清从而对人体进行免疫分析的医学检验仪器。将定量的患者血清和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的游离成分。然后，加入鲁米诺Luminol发光底液，利用化学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能量以光子的形式释放。此时，将微孔板置入分析仪内，通过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊断。方法步骤 实验步骤实验步骤 备注：因各厂家生产试剂操作方法备注：因各厂家生产试剂操作方法 不同，故参见试剂盒说明书不同，故参见试剂盒说明书 结果判断及临床意义 一、结果判断 结果判断 Part 1 胶体金免疫层析法结果判断胶体金免疫层析法结果判断 以艾康生物检测试剂盒为例：以艾康生物检测试剂盒为例：阳性（+）：两条红色条带出现，一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区（C）。阳性结果表明：标本中含有待测物质。阴性（-）：仅质控区（C）出现一条红色条带，在测试区（T）内无红色条带出现。阴性结果表明：标本中检测不出待测物质。无效：质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试纸条已变质损坏。在任何情况下，应重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。注意：测试区（T）内的红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判为阳性结果。结果判断 Part 1 胶体金免疫层析法结果判断胶体金免疫层析法结果判断 阳性（+）：仅质控区（C）出现一条红色条带，在测试区（T）内无红色条带出现。阳性结果表明：标本中含有待测抗体。弱阳性（+）：质控区（C）出现一条红色条带，在测试区（T）内有非常弱的红色条带出现。弱阳性结果表明：标本中含有少量待测抗体。阴性（-）：两条红色条带出现，一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区（C）。阴性结果表明：标本中检测不出待测抗体。无效：质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试纸条已变质损坏。在任何情况下，应重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。结果判断 Part 2 酶免疫技术酶免疫技术 以上海科华试剂盒为例：以上海科华试剂盒为例：1 HBsAg：COV=阴性对照平均OD值+0.1 样本OD值/COV值1.0为阳性 样本OD值/COV值1.0为阴性 2 HBsAb、HBeAg：COV=阴性对照平均OD值2.1（OD0.05按0.05计算）当样本OD值COV值为阳性 当样本OD值COV值为阴性 结果判断 Part 2 酶免疫技术酶免疫技术 3 HBeAb：COV（阴性对照平均OD值阳性对照平均OD值）0.5 标本OD值COV为阴性，COV为阳性 4 HBcAb：原倍血清COV阴性对照平均OD值0.3 1:30稀释血清COV阴性对照平均OD值0.5 标本OD值COV为阴性，COV为阳性 二、临床意义 临床意义 临床意义 临床意义 HBsAgHBsAg的定量检测是目前监测和预测抗的定量检测是目前监测和预测抗乙肝病毒治疗后应答的新工具，结合乙肝病毒治疗后应答的新工具，结合HBV DNHBV DNA A及乙肝病毒及乙肝病毒e e抗原（抗原（HBeAgHBeAg）的阴转和血清）的阴转和血清转换，我们能更准确地预测患者的近期和远转换，我们能更准确地预测患者的近期和远期抗病毒治疗的疗效。因此，该检测已在临期抗病毒治疗的疗效。因此，该检测已在临床上得以广泛开展，特别是被用于判定抗病床上得以广泛开展，特别是被用于判定抗病毒治疗疗效，以及根据早期下降的速度和幅毒治疗疗效，以及根据早期下降的速度和幅度来预测远期疗效及决定疗程上。度来预测远期疗效及决定疗程上。临床意义 聚乙二醇干扰素（聚乙二醇干扰素（Peg IFNPeg IFN）-2a2a治疗乙肝患者治疗乙肝患者的研究结果显示，治疗的研究结果显示，治疗1212周时周时HBsAgHBsAg定量定量1500 IU/ml20000 IU/ml20000 IU/ml（约占治疗人群的（约占治疗人群的16%16%）,则治疗结束停则治疗结束停药药1 1年时的年时的HBeAgHBeAg血清转换率仅为血清转换率仅为19%19%（8/438/43例）。例）。临床意义 此外，研究还发现，患者治疗后此外，研究还发现，患者治疗后HBsAgHBsAg下降速下降速度和幅度还与其长期清除率有关。在治疗度和幅度还与其长期清除率有关。在治疗2424周周HBsHBsAg1500 IU/mlAg1500 IU/ml且同时出现且同时出现HBeAgHBeAg血清转换的患者血清转换的患者中，有中，有20%20%可获得可获得HBsAgHBsAg清除。因此，清除。因此，HBsAgHBsAg定量可定量可以用于指导治疗。而且，治疗结束时以用于指导治疗。而且，治疗结束时HBsAgHBsAg水平越水平越低，停药后随访的低，停药后随访的HBsAgHBsAg清除率越高。清除率越高。临床意义 布鲁内托（布鲁内托（BrunettoBrunetto）研究显示，无论是）研究显示，无论是HBeAgHBeAg（+）还是还是HBeAgHBeAg（-）的慢性乙肝患者，在接受干扰素治疗）的慢性乙肝患者，在接受干扰素治疗4848周后，若其周后，若其HBsAgHBsAg定量定量10 IU/ml10 IU/ml10 IU/ml（占（占88%88%，171/19171/194 4例），随访例），随访3 3年，仅有年，仅有2%2%（4/1744/174例）的患者出现例）的患者出现HBsAgHBsAg消失。同样，治疗消失。同样，治疗4848周时周时HBsAgHBsAg下降下降2 log2 log的患者，的患者，随随访访3 3年，年，HBsAgHBsAg消失率高达消失率高达42%42%；下降；下降2 log2 log患者中，仅有患者中，仅有3%3%的的HBsAgHBsAg消失。因此，在治疗结束时，对于那些消失。因此，在治疗结束时，对于那些HBV DNHBV DNA A 阴转并出现阴转并出现HBeAgHBeAg血清转换的患者，如果血清转换的患者，如果HBsAgHBsAg水平下水平下降不明显，可考虑延长疗程，以进一步提高降不明显，可考虑延长疗程，以进一步提高HBeAgHBeAg血清转血清转换率和换率和HBsAgHBsAg清除率。清除率。临床意义 检测模式分析检测模式分析 Part 4 检测结检测结果模式分析果模式分析 HBsAgHBsAg HBsAbHBsAb HBeAgHBeAg HBeAbHBeAb HBcAbHBcAb PreS1AgPreS1Ag PreS1AbPreS1Ab 简要意义简要意义 乙肝乙肝表面表面抗原抗原 乙肝乙肝表面表面抗体抗体 乙肝乙肝E 抗原抗原 乙肝乙肝E抗抗体体 乙肝乙肝核心核心抗体抗体 乙肝乙肝前前S1抗原抗原 乙肝