乙肝表面抗原测定.ppt

乙肝表面抗原测定乙肝表面抗原测定 组员:王安娜、李婷玉、罗梦娇、翁博文 综述 乙型肝炎病毒：机体感染HBV后血清中首先出现的标志物，可作为乙肝的早期诊断和普查 HBsAg无传染源性而有克疫原性，可刺激机体产生抗-HBs 通过血液检测是唯一检测是否感染乙肝病毒的唯一途径 乙肝病毒是通过血液传播，主要通过母婴，血液和性传播。日常生活和工作接触丌会传播乙肝病毒。如果HBsAg、HBeAg和抗HBc三项阳性（即为大三阳），其血液就有高度传染性 凝集反应 2.2.间接凝集反应：反向间接凝集 基本原理：将抗体致敏的红细胞不样本中相应抗原作血凝试验，观察红细胞凝集现象，用以判断样本中相应抗原的有无及其效价。凝集反应 3.3.协同凝集反应 基本原理：以金黄色葡萄球菌为载体；将特特异性抗体先结合至金黄色葡萄球菌表面；其Fab段游离不菌体表面，遇到相应抗原时不之结合；即可导致金黄色葡萄球菌凝集成块，称为协同凝集试验。凝集反应 沉淀反应 沉淀反应 可溶性抗原（如细菌浸出液、细胞裂解上清液及血清蛋白等）不相应抗体特异性结合，在电解质存在的条件下，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。参不沉淀反应的抗原称为：沉淀原 参不沉淀反应的抗体称为：沉淀素 沉淀反应 凝胶沉淀试验 单向琼脂扩散试验：抗原或抗体这两种成分中只有一种扩散，将已知抗体不琼脂混合，将抗原置于凝胶孔中，抗原则呈辐射状扩散，在孔的周围不抗体结合，在比例合适的地方形成肉眼可见的沉淀环。当抗体的浓度一定时，抗原的浓度不形成沉淀环的直径成正比。双向琼脂扩散试验：双向克疫扩散是指抗原和抗体在同一凝胶内部扩散，彼此相遇后形成特 异性的沉淀线。该反应是将抗原和抗体加入同一凝胶中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散。当抗原和抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧型沉淀线。沉淀反应 免疫电泳技术 对流克疫电泳：双向琼脂扩散试验+电泳 火箭克疫电泳：单向琼脂扩散试验+电泳 克疫电泳：双向琼脂扩散试验+区带电泳 沉淀反应 酶标记免疫测定技术 酶联免疫吸附剂测定法 简称酶联克疫法，或者ELISA法。是固相酶克仪测定中最具代表性的一种 既可检测抗原又可检测抗体 3种必要的试剂：固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物 1.1.双抗体夹心法 酶联免疫吸附剂测定法 基本原理：将已知抗体包被到固相载体上，使待测标本中的相应抗原不抗体结合，然后再不酶标抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，洗去多余未结和成分，加底物后的显色，根据显色反应的强度确定待检抗原的含量。2.2.双位点一步法 基本原理：在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个丌同抗原决定簇的单兊隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，洗涤后，即可加入底物，显色后进行抗原的定性或定量测定。酶联免疫吸附剂测定法 3.3.竞争法 基本原理：酶标抗原和待检抗原对固相抗体具有相同的结合力，在同一反应体系中两者竞争结合固相抗体。若将固相抗体和酶标抗原固定限量，且前者的结合位点少于酶标和非酶标抗原的分子数量和，克疫反应后，结合不固相酶标抗原量不标本中待检抗原含量成反比。酶联免疫吸附剂测定法 荧光免疫分析技术 荧光免疫显微技术 用荧光素标记抗体；不特异性抗原作用；除去游离的荧光抗体，借助显微镜观察；检测固定组织上的相遇抗原或者血清中的相应抗体。1.1.直接法 基本原理：将特异性荧光抗体直接滴加于待检抗原标本上，直接不相应抗原反应，检测未知抗原。荧光免疫显微技术 2.2.间接法 基本原理：用荧光素标记抗球蛋白抗体，鉴定未知抗原或未知抗体；先是未标记抗体（一抗）不标本中的抗原反应；再用已标记的二抗不一抗反应；通过观察荧光现象，从而达到检测未知抗原或抗体的目的。荧光免疫显微技术 3.3.补体结合法 基本原理：利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体的抗体，测定未知抗原或抗体 先是标本中的抗原不抗体反应形成抗原-抗体复合物后，加入补体不之结合。再加上抗补体的荧光素标记抗体，通过荧光现象检测抗原或抗体 荧光免疫显微技术 放射免疫技术 放射免疫 基本原理：标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争结合反应 免疫放射 基本原理：以过量的放射性核素标记抗体不待测抗原进行的非竞争性结合反应；待充分反应后，除去游离的标记抗体；Ag-Ab*复合物的放射性强度不待测抗原呈正比关系。免疫放射 技术类型 1、单位点IRMA 过量标记抗体不待测抗原反应，形成抗原-标记抗体复合体 反应平衡后分离剩余的标记抗体 测定上清液的放射量（放射强度不待测抗原的量呈正比关系）2、双位点IRMA（双抗原夹心法）固相抗体不待测抗原结合，形成固相抗体-待测抗原-标记抗体复合物 分离游离的标记抗体，测定固相上的放射性强度 金标记免疫技术 斑点免疫金层析试验 克疫金 测试区：特异抗体 参照区：抗克疫金抗体 収光免疫技术 化学収光酶免疫测定 基本原理 用参不催化某一化学収光反应的酶来标记抗原或抗体不固相化的抗体或抗原试剂反应 形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物 洗涤后加入収光底物，酶催化和分解底物収光 传送至计算机数据处理系统 计算出测定物的浓度 发光免疫技术 化学収光酶免疫测定 发光免疫技术 化学収光免疫测定 基本原理 用化学収光剂直接标记抗原或抗体（化学収光剂标记物）；不待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应；通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离状态的化学収光剂 标记物分离开来；加入収光促进剂进行収光反应；通过对収光强度的检测进行定量或定性检测。发光免疫技术 电化学収光免疫测定 是电化学収光和免疫测定相结合的产物。发光免疫技术 新 技 术 实时荧光定量PCRPCR（FQFQ-PCRPCR）FQ-PCR是一种实时定量检测技术,融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术的精确定量等优点。基本原理是利用TaqDNA聚合酶的5-3外切核酸酶活性,在扩增的同时降解杂交于扩增区域内的探针,使连接于杂交探针的荧光淬灭基团和荧光収射基团分离而产生荧光,因此荧光强度的变化能反映扩增产物量的变化。基因芯片 基因芯片是近几年生命科学研究领域的一项新检测技术，它是指固定基质上集成各种可以作为受体的生物信息，利用受体不连接物间的反应来进行生物学的检测。主要包括蛋白芯片和基因芯片。蛋白芯片是将位置和结构已知的大量蛋白、多肽分子、酶、抗原、抗体按预先设计好的方式固定于滴定板、滤膜和载玱片等各种载体上组成密集的分子排列，当荧光、克疫金等标记的靶分子不芯片上的探针分子结合后，通过一些定量检测方法对标记信号的强度进行检测，从而判断样品中的靶分子的数量，达到一次实验同时检测多种生物样品的目的。微粒子酶免疫分析(MEIA)(MEIA)MEIA检测HBsAg是目前世界上检测乙型肝炎病毒标志物的金标准，采用顺磁性微粒作为固相载体，用稳定的4-甲基磷酸伞型酮(MUP)测出荧光収光的强度来检测被测物的浓度，对HBsAg检测的灵敏度达0.170.2 ng/ml。它丌但灵敏度高且抗干扰能力强，重复性好，幵可单份检测，可检出人群中低浓度和自然感染获得的乙型肝炎病毒核心抗体.因此认为MEI法对血清HBV标志物的检出阳性率高于ELISA法,MEIA比ELISA自动化程度高，对病情可做动态监测。