下呼吸道感染细菌学检验操作规范.doc

下呼吸道感染细菌学检验操作规范 一、相关临床知识 临床通常将正常人喉以上部位称之为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌。下呼吸道感染包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管扩张继发感染及肺实质感染(肺炎、肺脓肿)等。病原体有细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体和原虫等。 下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音、白细胞总数及嗜中性粒细胞比例明显增高，x线检查提示肺部有炎症性浸润或胸腔积液等体症，严重时可导致感染性休克和呼吸衰竭，因此临床诊断一般不难；细菌学检验能明确感染病原，并提供有关抗菌药物对分离菌的抗菌活性等信息，有助于疾病治疗、流行病学调查研究和医院感染的监测。临床呼吸道标本中常见分离细菌见表1 表1 呼吸道标本中的常见分离细菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 草绿色链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌 韦荣球菌 表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、其他葡萄球菌 脑膜炎奈瑟菌、其他奈瑟菌 微球菌、消化链球菌、消化球菌、 卡他莫拉菌 肠球菌 肺炎克雷伯菌及其他克雷伯菌 真杆菌、丙酸杆菌、乳酸杆菌 沙雷菌、变形杆菌 放线菌、奴卡菌、结核分枝杆菌 大肠埃希菌及其它肠杆菌科细菌 白喉棒状杆菌、类白喉棒状杆菌 百日咳鲍特菌、不动杆菌 念珠菌 铜绿假单胞菌及其他假单胞菌属细菌、 嗜肺军团菌、气单胞菌 流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌 拟杆菌、梭杆菌 二、标本采集 本室必须注意生物安全防护。 (一)采集方法 1．自然咳痰法 以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开水漱口或牙刷清洁口腔和牙齿，有假牙者应取下假牙。尽可能在用抗菌药物之前采集标本。用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量应≥lml。标本应尽快送检，不能及时送检的标本，室温保存≤2h。 2．支气管镜采集法、防污染毛刷采集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法均由临床医生按相应操作规程采集，但必须注意采集标本时尽可能避免咽喉部正常菌群的污染。 3．小儿取痰法 用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。 (二)标本验收 遇有不合格标本，应及时与临床联系，报告不合格标本拒收的具体理由。下呼吸道标本验收与拒收见表2。 表2 下呼吸道细菌学培养标本验收与拒收 厌氧菌培养 呼吸道定植有大量的正常菌群，咽试子、咳痰、吸出的分泌物厌氧菌培养无意义。 标识错误 申请单必须填写应完整。标本标识必须唯一，并与申请单相符，未标明采集时间、部位或检验要求等拒收。 肉眼观察 痰标本呈水样或唾液样，拒收。 标本涂片细胞学检查 白细胞数<10／低倍镜和鳞状上皮细胞数>25/低倍镜，提示该标本已污染正常菌群，建议重送标本。 容器不符合规定 标本容器必须符合规定，溢漏、无盖者拒收。 运送不符合规定 标本采集后送检时间超过2h拒收。 双份标本 同时同部位或同一天两份相同检测的标本(应与申请医师协商处理)。 三、实验室检查 (一)肉眼观察 观察痰液的颜色、粘度、有无血丝和是否呈脓性，如见有颗粒存在，则应注意可能与放线菌属及奴卡菌属感染有关。 (二)显微镜检查 下呼吸道细菌学检验的标本均需涂片进行细胞学和细菌学显微镜检查，其目的是判别送检标本是否适合做细菌培养，并初步判定有否病原菌、病原菌的数量及其类别，有助于初步报告、选择培养基(如真菌)和对培养结果的综合分析。合格的标准见表3。 表3 痰涂片显微镜细胞学检查判别标本合格的标准 分类 细胞数／低倍镜 备注 白细胞 鳞状上皮细胞 A >25 <10 合格可用于细菌培养 B >25 10~25 尚合格可用于细菌培养 C <10 >25 不合格，重送标本 2．细菌涂片染色检查 挑取痰液中脓性或带血部份涂成均匀薄片，革兰染色后镜检，油镜下观察细菌形态，排列和染色性，可初步推定菌属(或种)，涂片中所见细菌的量及吞噬细胞内是否有细菌等。如发现酵母样菌或菌丝或孢子，应做出相应报告和真菌学检查。 四、分离培养 1．痰标本培养前处理 不含或含粘液很少的标本，可直接接种，遇有含大量粘液的标本，应加入等量的液化剂(如pH7.6的10g/L胰酶溶液等)，放置35℃待充分液化再行接种。亦可加液化剂后用旋转混匀器搅拌混匀，3000r／rain离心l0min，弃上清液，取沉淀物接种培养基。 2．一般细菌培养 (1)培养基选择 1)血平板 适用于分离肺炎链球菌和其他细菌。 2)加抗生素的巧克力平板 适用于分离嗜血杆菌。 3)麦康凯／中国兰平板 适用于分离革兰阴性杆菌。 (2)分离培养 将处理后痰标本分别划区接种于血平板、巧克力平板和麦康凯平板 ／中国兰平板，35℃孵育，血平板和巧克力平板需置5％CO2环境，详见检验流程图1。 痰及下呼吸道分泌物标本 ↓ 肉眼观察及涂片革兰染色细菌学和细胞学显微镜镜检 ↓ ↓ ↓ 初步报告 合格标本 不合格标本 ∣ 培养前处理 ∣ ∣ ∣ ↓ ∣ ∣ 拒收及建议重新采集合格标本 ∣ ∣ ∣ ↓ ↓ ↓ ∣ 血平板 巧克力平板 麦康凯／中国兰平板 ∣ (5％C02环境) (5％C02，环境) (需氧环境) ∣ ↓ ∣ 菌落观察 涂片染色镜检 ↓ ↓ 结合涂片细胞学和细菌学显微镜镜检结果与培养结果综合分析 ↓ ↓ ↓ 细菌鉴定 药敏试验 ↓ ↓ 结合涂片细胞学和细菌学显微镜镜检与细菌学培养鉴定、药敏结果综合分析 ↓ 结果报告(最终报告) 图1 痰及下呼吸道标本细菌学检验的操作流程 (3)结果分析 痰及下呼吸道分泌物标本易受到定植在上呼吸道的正常菌群污染，进行细菌学检验时通常可从送检的标本中分离出多种细菌，确定哪一种分离细菌是引起下呼吸道感染的病原菌，这对临床诊断与治疗感染性疾病至关重要。在实际工作中，有时也由于细菌生长速度不一，如肺炎链球菌可能被生长速度快的细菌(包括正常菌群)菌落掩盖，不仔细观察就会忽略检验。 当在同一培养基上分离出1种以上的病原菌（复合菌）时，应主动与临床医师联系，结合患者的临床症状、痰涂片染色显微镜镜检及近期细菌培养结果(如近期同一病人多次分离培养出同一种菌)等综合判断所分离的多种细菌中哪一种菌可能为致病菌，通常为优势菌，即分离培养的某一种细菌的相似菌落计数为多数或纯菌落。当分离优势菌与涂片染色显微镜镜检结果相符时，优势菌必需进行药敏试验。若分离培养结果与涂片染色显微镜镜检结果不相符时，可不进行药敏试验(以免误导)，仅报告分离细菌鉴定结果。 五、报告方式 (一)下呼吸道标本细菌学检验结果报告 由于检验结果报告时效性，下呼吸道标本细菌学检验结果分为初步和最终结果报告。 初步报告 应包括标本涂片革兰染色细胞学和细菌学显微镜镜检的描述性报告(发现有诊断价值时及时可口头报告，但应按要求详细纪录)； 最终结果 报告应包括送检标本肉眼观察的结果、涂片革兰染色细胞学和细菌学显微镜镜检的描述性报告、分离致病菌的鉴定结果、药敏试验结果和评述性意见(建议)等。 涂片革兰染色细胞学和细菌学显微镜镜检的描述性报告 细菌学显微镜镜检的描述性报告：如镜检见到排列成葡萄状的革兰阳性球菌，可报告“找到革兰阳性球菌，形似葡萄球菌”；如见到瓜子仁形成矛头状端相背，成双排列，具有明显荚膜的革兰阳性球菌时，可报告“找到革兰阳性球菌，形似肺炎链球菌”；如见到不易识别的细菌时则报告“找到革兰X性X形细菌”； 细胞学显微镜镜检的描述性报告：包括白细胞数/低倍镜、细胞内有否含有细菌和胞内细菌染色及形态学特性。 (二)下呼吸道标本细菌学检验四种常见的结果报告形式： L标本涂片革兰染色细胞学和细菌学显微镜镜检未发现有临床诊断意义结果(可不用初步报告)，同时分离培养的细菌为定植的正常菌群，最终检验结果应报告“正常菌 群”。 2．标本涂片革兰染色细胞学和细菌学显微镜镜检发现有临床诊断意义结果(及时初步报告)，同时分离培养检出优势菌，对优势菌初步检验与涂片染色显微镜镜检结果相符时，除及时初步报告外，最终检验结果应报告标本肉眼观察的结果、涂片革兰染色细胞学与细菌学显微镜镜检的描述性报告、优势菌鉴定的规范细菌名称和药敏试验结果及评述性意见(建议)等。 3．标本涂片革兰染色细胞学和细菌学显微镜镜检发现有临床诊断意义结果(及时初步报告)，细菌分离培养未检出优势菌，涂片染色显微镜镜检与细菌分离培养结果不相符时，除及时初步报告外，最终检验结果应报告标本肉眼观察的结果、涂片革兰染色细胞学与细菌学显微镜镜检的描述性报告和“未培养出病原菌”。