人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定(精).doc

     人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定           关键词：骨形成蛋白-7； 克隆； 序列测定 中号： Q786　文献标识码：B　文章编号：1007－8738(2000)03－0213－02▲ 　　人骨形成蛋白?7(hBMP?7)最早由Celeste等〔1〕克隆并命名。同年，Ozkaynat等〔2〕从人脑cDNA文库中也筛选出此克隆。以后研究表明，BMP?7除了诱导成骨外，还具有广泛的生物学活性〔3－6〕。由于hBMP?7在神经系统及造血组织中的特殊作用，故其在基础研究和临床应用中具有广阔的前景。我们采用自行设计合成的一对特异性引物，以骨肉瘤的λgt11噬菌体表达文库为模板，通过PCR扩增到hBMP?7成熟肽的cDNA。将其克隆入载体pGEM?3zf(?)，所获序列与已发表的序列完全一致，为进一步对其表达和功能研究创造了条件。 　　1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 　　1:PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377和237bp)；2：PCR产物. 　　2重组质粒pGEB7的酶 　　切鉴定 　　1：PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377和237bp)；2：重组质粒pGEB7的EcoRI＋HindIII双酶切. 　　1　材料和方法 　　1.1材料大肠杆菌DH5α及质粒pGEM?3zf(-)均为本室保存。骨肉瘤细胞U2-OS的λgt11噬菌体表达文库为本室构建。各种限制性内切酶、连接酶和Taq酶均为Gibco公司的产品。AdvantagePCR-purekit为Clontech公司产品。常用试剂为进口分装或国产分析纯。PCR扩增引物自行设计，由上海生物工程中心合成。引物的序列如下： 　　P1：5′TTTAAATGTCCACGGGGAGCAAAC3′; 　　P2：5′GCGTCGACTTAGTGGCAGCCACAG3′. 　　1.2方法 　　1.2.1hBMP?7成熟肽基因的扩增PCR反应体系：P1和P2引物(20mmol/L)各1μL，dNTP(10mmol/L)1μL，模板λgt11噬菌体3μL，10×PCRbuffer5μL和Taq酶1U，加水至总体积50μL。PCR反应条件：94℃30s，50℃30s，72℃30s反应5个循环。然后，于94℃30s，55℃30s，72℃30s，反应30个循环。PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。 　　1.2.2重组质粒的构建用HincII酶切载体pGEM?3zf(-)并回收，同时回收PCR产物，用T4连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆。 　　1.2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪进行。 　　2　结果 　　2.1hBMP-7成熟肽基因的扩增以λgt11噬菌体表达文库为模板，利用自行设计的一对引物，进行PCR扩增hBMP-7成熟肽基因。经两段反应共35个循环后，用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得约440bp的特异条带，与预期的大小相一致(1)。 　　2.2重组质粒的构建回收440bp片段，在T4连接酶作用下，与用HincII酶切的质粒pGEM?3zf(-)于16℃连接过夜。以连接产物转化感受态细胞DH5α，加入IPTG和X-gal进行蓝白筛选。随机挑取白色克隆，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切。经15g/L琼脂糖凝胶鉴定表明，切出440bp片段者为阳性克隆(2)，将此重组质粒命名为pGEB7。 　　2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪测定hBMP?7成熟肽基因的序列，所得结果与已发表的序列完全一致(3)。 　　TCCACGGGGAGCAAACAGCGCAGCCAGAACCGCTCCAAGACGCCCAAGAACCAGGAAGCC(60) 　　CTGCGGATGGCCAACGTGGCAGAGAACAGCAGCAGCGACCAGAGGCAGGCCTGTAAGAAG(120) 　　CACGAGCTGTATGTCAGCTTCCGAGACCTGGGCTGGCAGGACTGGATCATCGCGCCTGAA(180) 　　GGCTACGCCGCCTACTACTGTGAGGGGGAGTGTGCCTTCCCTCTGAACTCCTACATGAAC(240) 　　GCCACCAACCACGCCATCGTGCAGACGCTGGTCCACTTCATCAACCCGCAAACGGTGCCC(300) 　　AAGCCCTGCTGTGCGCCCACGCAGCTCAATGCCATCTCCGTCCTCTACTTCGATGACAGC(360) 　　TCCAACGTCATCCTGAAGAAATACAGAAACATGGTGGTCCGGGCCTGTGGCTGCCACTAG(420) 　　3BMP?7成熟肽编码基因的部分核苷酸序列 　　3　讨论 　　hBMP-7具有广泛的生物学活性：①胚胎发育中所产生的BMP-7和BMP-4是诱导交感神经元分化的信号分子。②能抑制胚胎癌性细胞(ECC)的增殖，诱导其分化，可能对一些干细胞肿瘤有治疗价值。③对牙齿的修复、形成有重要作用。④对鼠胚胎菱脑的发育和形成有一定影响，为哺乳动物眼部发育所必需〔5〕。剔除(knock?out)该基因的小鼠出生不久即死于肾脏发育不良，提示其可能与小儿肾功能不良所致贫血和骨骼发育不良有关，从而使其在基础研究和临床应用等方面具有比较重要的价值。但天然来源的BMP-7较少，限制了对其功能的研究。国外多用真核表达系统表达BMP-7，只有极少数人尝试用原核表达系统进行表达研究〔7〕，并获得活性产物。以往认为，BMP原核表达后，难以获得高活性的产物，且表达产物往往处于非溶解状态，可溶性产物的量极少。近来本室在原核表达的BMP-2的复性方面获得了突破〔8〕，可得到大量可溶性重组BMP产品，为其体外活性测定方法的建立及功能研究提供了极大的便利。为进一步阐明BMP?7结构与功能的关系，研究其在肾脏、神经系统发育及造血系统中的作用，克隆BMP-7成熟肽基因很有必要。 　　我们以骨肉瘤细胞U2-OS的λgt11噬菌体表达文库为模板，利用自行设计的一对引物，仅一轮扩增即得到单1条带。测序结果表明，设计的引物特异性强，扩增得到的基因正确。将扩增产物以平端克隆入载体pGEM?3zf(-)，可避免由于酶切处理过程的损失，无论是正向或反向克隆入载体都不影响测序，而且不会破坏引物中所含的酶切位点和起始密码子。hBMP-7成熟肽基因克隆的成功，为其原核表达以及功能研究和应用奠定了基础。■ 作者简介：王琦，男，24岁，助教现工作单位：兰州市段家滩171号，解放军兰州医高专生化教研室，Tel.(0931)8972157 ? 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@ ISSN 1007? 8738 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 (J Cell Mol Immunol)2000;16(3) 王琦（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 柴玉波（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 李毅（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 陈南春（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 薄勤（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 陈苏民（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 参考文献： 〔1〕 Celeste AJ, Iannazzi JA, Taylor RC, et al. Identification of transforming growth factor family members present in bone inductive protein purified form bovine bone〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1990; 87:9843－ 9847. 〔2〕 Ozkaynak E, Rueger DC, Drier EA, et al. OP? 1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF? β family〔J〕 . EMBO J, 1990; 9: 2085－ 2093. 〔3〕 Reissmann E, Ernsberger U, Francis? West PH, et al. Involvement of BMP4 and BMP7 in differentiation of the adrenergic phenotype in developing sympathetic neurons〔J〕 . Development, 1996; 122(7):2079－ 2088. 〔4〕 Giannobile WV, Ryan S, Shih MS, et al. Recombinant human osteogenic protein? 1 (OP? 1) stimulates periodontal wound healing in class III furcation defects〔J〕 . J Periodontol, 1998; 69(2):129－ 137. 〔5〕 Arkell R, Beddington RS. BMP? 7 influences pattern and growth of the developing hind? brain of mouse embryos〔J〕 . Development, 1997; 124:1－ 12. 〔6〕 Luo G, Hofmann C, Bronckers AL, et al. BMP? 7 is an inducer of nephrogenesis, and is also required for eye development and skeletal patterning〔J〕 . Genes Development, 1995; 9:2808－ 2820. 〔7〕 Wolfman NM. Mutants of bone morphogenetic proteins〔P〕 . 美 国 专 利 U.S.Patent. 1995; PN:5,399,677. 〔8〕 田琼，张绍章，蒲勤.重组人骨形成蛋白-2成熟肽对小鼠辐射损伤的治疗作用及其机制的探 讨〔J〕. 中华放射医学与防护杂志，1998；18（4）：253－255.