BDFACSVerse流式细胞仪样品测试操作流程.pdf

BD FACSVerse 流式细胞仪样品测试操作流程流式细胞仪样品测试操作流程 1开机前或关机后检查鞘液桶中是否需要添加鞘液；清空废液桶中的废液后，添加 500ml NaClO 溶液（NaClO 原液稀释 20 倍使用）清洗废液桶，并用纯净水清洗干净（注意：仪注意：仪器运行时最好不要进行此项操作器运行时最好不要进行此项操作）；鞘液成分：一定浓度的 NaN3（叠氮化钠）或使用标准较高的纯净水；2开电脑（仪器开机密码：BDIS#1），电脑主机显示屏右下角网络连接图标显示为号；3按下仪器 Power 键，启动仪器（正常启动，电源键为绿色），20 分钟后激光器预热完成；4待号变为！时，即可运行 FACSuit 软件（软件密码：bdadministrator）；连接成功，则工作界面左下角状态符号显示为 Connected；液流系统就绪，则工作界面左下角状态符号显示为 Fluidics；5仪器开机或运行时出现故障，根据提示信息操作后仍然无法修正，根据以下途径获得故障发生时产生的报告：a)在 FACSuite 软件中的 Cytometer Maintenance Generate System Health Report，根据日期、时间将生成的两个文件拷贝出来：system health report connected_月日年 txt.和 zip 文件。b)关闭 FACSuite 软件，在电脑桌面上找到 ServiceClient 文件夹，打开，找到 ServiceClient.exe 文件，双击打开，选择 Cytometer Connect Get Log File，根据提示将其存在自定义的位置，将以上文件发送给您所在区域的工程师或技术支持，或拨打 400-819-9900 以获得准确、有效的支持；6正式测定样品前，自下而上执行以下 4 步操作：Cytometer Fluidics （1）SIT Flush 反冲，执行此步操作前取下样品管（自动结束）；（2）Purge Sheath Filter排气泡、清洗；（3）Drain and Fill Flow Cell 流动室排空气，上样针处添加一管干净的蒸馏水，点击确定；（4）Clean Curvette 清洗流动室，此步所需水量稍多，管中水量不能太少（23ml）；7上述 4 步完成之后，先做一个水样，测试仪器状态，Flow rate 调制 High，水样较为干净时，Threshold Rate 值较小，一般在 50events/s 以下；8水样完成之后，取下样品管，进样针上的指示灯为黄色，指示灯变为绿色时，即可套上测试样品；9 第一个测试样品为阴性对照样品（细胞未用任何荧光染料进行染色），Flow rate 调制 Low，主要用于调试电压，电压调试好之后，细胞位于 FSC-ASSC-A 图像角落；阴性对照样品需要的量较多，应加大备用量；样品测试时，先点击 Preview（采样，但不收集数据），1 然后调试电压，点击 Restart，重复 3 次左右即可将电压调适好；电压调试好之后，点击Acquire，开始采样同时收集数据；10测试完成之后，操作软件中点击 next tube 添加新的样品管（该管属性带有上一样品管属性），并选中；取下样品管，仪器自动反冲（灯光为黄色），灯光变为绿色即可上下一个样品；下一个测试样品为单个荧光染料进行染色的样品，主要用于调整荧光补偿值；调整好之后，荧光染色细胞重心高度与阴性对照细胞一致，其它荧光强度数值为 0；11样品用 n 种染料进行荧光标记，则需要进行 n 次调整荧光补偿值；单个染料进行荧光标记，则不需要调整荧光补偿值；12测试完成之后，操作软件中点击 next tube 添加新的样品管（该管属性带有上述所有样品管属性），并选中；取下样品管，仪器自动反冲（灯光为黄色），灯光变为绿色即可上正式样品管（多重荧光染料同时标记不同类群的细胞）；13正式样品测试完成，即可进行数据分析，包括门的设置（分析某一类群细胞）、添加十字象限、细胞成分分析；14样品测试全部完成，执行 daily clean，将 3ml 稀释 20 倍 NaClO（国产原液）溶液上样，高速运行 10 分钟，清洗管路；15NaClO 溶液清洗完成，用标准较高的纯水 3ml 走样 2 次，每次 15 分钟，清洗管路中残存的 NaClO；16清洗完成，点击 Cytometer 菜单中的 shut down，仪器状态灯由绿色变为黄色，即可关闭电源，随后关闭电脑和显示器；17进样针处保留 1 管较为干净的除离子水（任何时候进样针处样品管不能为空，仪器未使用时需添加适量的除离子水）。2 BD FACSVerse 流式细胞仪维护及注意事项流式细胞仪维护及注意事项 1仪器所处环境温度保持 22左右，湿度控制在 60以下；2关机后进样针处保留 1 管较为干净的除离子水；3过滤器发黑、杂质较多则需要更换，一般情况下过滤器每 6 个月更换一次；4鞘液使用叠氮化钠（仪器生产厂家销售），或使用标准较高的纯净水替代；国产 NaClO原液需要用纯净水稀释 20 倍后方可用于仪器管路的清洗。5每 6 个月做一次 CQC（仪器质控），每 1 个月做一次 PQC（仪器质控），检测仪器状态是否正常（500ul 纯净水2 滴质控小球，质控小球商品化销售）；管路较脏，cv 值偏大，清洗仪器即可；若质控不通过，唯一能做的就是清洗管路或重新配置小球，或询问技术工程师解决方法；6仪器使用频率较低，降低激光器使用寿命；长时间无样品测定时，每周开机 1 次，测定 1个水样，操作步骤如下：开仪器主机预热开电脑及显示器执行正式测样前 4 步操作测 1 个水样 30 分钟使用稀释 20 倍 NaClO 溶液清洗管路纯水 2 次清洗管路中残存的 NaClO关机、电脑及显示器（具体操作步骤见 BD FACSVerse 流式细胞仪样品测试操流式细胞仪样品测试操作流程作流程部分）；7仪器月清洗每 3 个月执行一次，进行月清洗之前，鞘液桶中的鞘液换成稀释 20 倍的 NaClO溶液（约需要 2 升），取下仪器过滤器，并用短接管短接（防止 NaClO 腐蚀过滤器），上样针处放上 3ml 稀释 20 倍的 NaClO 溶液或 3ml 纯水，按照软件提示信息进行操作；月清洗完成之后，取下短接管，重新将过滤器接上，剩余 NaClO 溶液倒掉，重新换上鞘液，同时清空废液桶中的废液；8样品测试全部完成，执行 daily clean，将 3ml 稀释 20 倍 NaClO（国产原液）溶液上样，高速运行 10 分钟，清洗管路；NaClO 溶液清洗完成，用标准较高的纯水 3ml 走样 2 次，每次 15 分钟，清洗管路中残存的 NaClO；清洗完成，点击 Cytometer 菜单中的 shut down，仪器状态灯由绿色变为黄色，即可关闭电源，随后关闭电脑和显示器。3 Perform Setup&QC 仪器质控仪器质控 1质控小球制备：500ul 纯净水2 滴质控小球（1 滴 20l），振荡充分混匀；若不立即检测，则避光保存（28保存，可用于 24h 内检测；1525保存，可用于 8h 内检测）；2质控小球批号导入方法：从 BD 公司网站（）下载与购买质控小球批号一致的文件（CS Beads Lots），解压到电脑文件夹中；点击 libraryBeads and ReagentsFC Beads/CS&T Beads（选中）Fileimport点击选中解压文件确定；3打开 BD FACSuite 软件，点击 Setup&QC 图标，在 Task 图标下选中 Perform QC，CS&T Beads Lot ID 选中小球批号；4配置好的质控小球放置在进样针处，点击 Start 图标，采集数据，仪器质控开始（质控功能：检测激光器调准；测量rCV、线性度、分辨率及激光功能；与 Characterization QC测得的rCV、线性度、灵敏度进行比较；确定 PMT 电压值，更新荧光补偿矩阵值，作为默认条件）；管路较脏，导致质控 cv 值偏大，需要清洗仪器管路；5提示检测完成后，可立即点击 yes 查看 PQC 结果报告，多次进行 PQC 质控，可追踪仪器性能条件的变化（折线图）；报告若出现警告、错误信息，参看 BD FACSVerse Syetem Users Guide 进行处理；6仪器质控（PQC）一般 1 个月做一次，CQC 每 6 个月做一次；商业销售的质控小球 1 瓶3000 元左右，可做 50 次仪器质控；4 双色实验双色实验案例案例（PI 和和 FITC 染色）染色）-参考参考 1 （1）开仪器、显示器、电脑、实验操作前的准备工作见“流式细胞仪样品测试操作流程”部分（2）开仪器软件，点击“Experiment”图标，新建实验。在 worksheet 里面画两张标准模式图。（a）全向角和侧向角散点图，X 轴 Label 为 FSC-A，Y 轴 Label 为 SSC-A，X 和Y 轴 Scale 均为 Linear。（b）另一张同样也是散点图，X 轴 Label 为 FITC-A（FITC染正在凋亡的细胞），Scale 为 BiExponential；Y 轴 Label 为 PI-A（PI 染死细胞），Scale为 BiExponential。设置方法：鼠标选中图像，右击鼠标，下拉菜单选择“Properities”，出现 Plot Editor 对话框，选择“Parameters”，对图像 X 和 Y 轴的 Label 和 Scale 进行设置（3）阴性对照样品命名为 Blank，将样品上样。首先需调节电压，使全向角和侧向角散点图上的细胞不压轴、不偏向 X 或 Y 轴、多数细胞处于图像左下角（4）收集细胞数量的设置：鼠标选中“Blank”样品管，右击鼠标，在下拉菜单中选择“Properities”，出现“Tube Properities-Blank”对话框，选择“Acquisition”，在 Stopping Rules/Create Gate Criteria/Events 中选择细胞数量，点击“Add Criteria”，在 Combine Gate Criteria and Apply Rule 下面框中出现 All Events+选择的细胞数量，点击“Apply Rule”，关闭窗口，完成设置。点击 Acquire，仪器开始细胞至设定值时自动停止 （5）在全向角和侧向角散点图中画门 P1，圈出需要分析的细胞群体。越靠近角落的细胞群体多为黏连或碎片细胞，因此需要选择具有活力的目标细胞群。在 FITC-API-A 图像中，设置仅显示 P1 门中的细胞群体。方法：鼠标选中图像，右击鼠标，选中“Properities”，5 出现“Plot Editor”对话框，在 General/Primiary Data Source/Parent Population 中，将P1 勾选上，关闭窗口，FITC-API-A 图像中仅显示 P1 门中的细胞（6）在 FITC-API-A 图像中画十字象限，使 P1 门中的细胞全部分布在一个象限内（处于图像左下角的象限内）。处于不同象限的细胞具有不同的活力状态：一般左上和右上象限细胞为死细胞，左下象限为活细胞，右下象限细胞为即将凋亡细胞。点击“Create rich text”图标，在图像上添加文字说明（7）点击“Next”，添加新的样品管，将 PI 单染的样品上样，并将 PI 染色的样品管名称更改为 PI。可设置 P1 门中收集细胞的数量。方法：选中 PI 管右击鼠标，选择“Properities”，出现“Tube Properities-PI”对话框，在 Acquisiton/Stopping Rules/Create Gate Criteria 里面设置，将 Gate 设置为 P1，Events 里面填写需要收集的细胞数量，点击“Add Criteria”，在 Combine Gate Criteria and App