军团菌病的研究进展.doc

摘要：由军团菌引起的军团菌病是非典型肺炎的重要组成部分。近年来从军团菌病的流行可以看出军团菌对人类健康的威胁已经达到不容忽视的程度。随着人们生活水平的提高，其发病率有上升趋势。因此对该病的研究也越来越受到人们的重视。本文就军团菌病有关研究近况进行了初步阐述。关键字：军团菌，军团病，现况，预防措施2003年4月，非典型肺炎肆虐人间，人们闻“非典”而色变。所谓“非典型肺炎(Atypical pneumonia,AP)”,是一组疾病,是相对于由肺炎链球菌(S. pneumoniae)引起的“典型肺炎(typical pneumonia,TP)”而言的。引起AP暴发和流行的病原体往往有多种,除新型冠状病毒外,嗜肺军团菌(Legionnairespneumophile,Lp)也是关键致病菌之一[1]。在没有找到引起SARS的真凶之前，Lp是专家怀疑的主要对象。军团菌病由气溶胶介导，是暴发流行或散发流行的严重呼吸道传染病，其流行致死率高达30%,散发致死率甚至高达69%[2]。因此,军团菌病在公共卫生上意义重大，倍受各方面的关注。1 军团菌病概述1.1该病首发于1976年的美国一次军人聚会，故称作军团病。次年从死者肺组织中分离出一种新的病原体，1978年国际上正式将该病原体命名为嗜肺军团菌。随后欧洲、澳洲等不同国家和地区相继发现军团菌病例。1982年,我国南京首次证实了军团菌病，1989年北京、1994年上海也出现了军团菌病例。随着认识的不断加深,人们对军团菌病的警惕性不断提高。国际上多个国家已将军团菌肺炎定为法定传染病之列。1.2 根据传播特点可将军团菌病分为以下几种：1.2.1医院获得性感染：多数院内军团菌病患者是由于其它疾病而住院治疗的病人,这些患者在自身免疫力低下的情况下受到军团菌感染而并发军团菌病。广西医科大学第一附属医院呼吸内科2000～2002年收治的13例军团菌肺炎患者中有6例为医院内感染 [3]。1.2.2社区获得性感染：在日常生活环境和公共场所中受到军团菌感染而致病的情况也比较多见。在以上13例患者中，由四人是一个家庭，说明他们在日常生活中接触了该致病菌而发病。1.2.3其他获得性感染：某些特殊职业使得工作人员在作业中接触军团菌污染源的机会较高,而逐渐感染军团菌病；或者长期在密闭、通风不良的空调办公室中工作的员工易发生该病。1.3军团菌病的传播特点与军团菌的生存方式有很大关系。在天然水体中,军团菌是常见菌。由于军团菌的营养要求比较特殊,在水温较低、营养较贫乏的天然水体中,军团菌不易繁殖。但军团菌在其它人工水体(如温泉等)中的情况则较为复杂。如果供水温度较高,或者供水管道和蓄水池的管壁和池壁上形成积垢和生物膜,就会为军团菌的大量增殖提供适宜的环境和营养条件。与此类似的还有冷却塔的循环水和空调的冷凝水,由于水温较高,管道中容易藏污纳垢,且容易形成死水区,为军团菌提供了良好的栖息和繁殖环境。因此军团菌病的主要污染源是供水系统及冷却塔和空调系统。1.4 气溶胶是军团菌传播、传染的重要载体。感染的主要途径是经呼吸道感染。军团菌的菌体微小,人在正常呼吸时,会将空气中含有军团菌的气溶胶吸入呼吸道内,致使军团菌有机会侵染肺泡组织和巨噬细胞,引发炎症,导致军团菌病。军团菌的另一个传播载体是原虫。Kuroki等[4]发现军团菌在阿米巴等原虫细胞内的寄生增强了其在环境中的存活能力、传播能力和致病性。当大量军团菌从原虫细胞内释放出来时,会成为军团菌病严重暴发的潜在危险因素。[!--empirenews.page--]1.5 近年来的有关生态学研究进一步揭示了军团菌长期存活于自然界水源的奥秘,许多藻类也可以为军团菌生长繁殖提供必需的营养因素。在对传染源的调研之中,有人提出军团病为人畜共患病的看法,因为很多证据表明在牛、羊等家畜中也有广泛的军团菌感染存在。存在这样的可能:受感染的人和动物排出的军团菌污染环境、土壤和水源,成为本病的传染来源。2 病原学2.1 军团菌是革兰阴性杆菌,不形成芽孢，无荚膜；不易被通常的革兰染料染色,可用改良的Ｄｉｅｔｅｒｌｅ饱和银染色法或直接免疫荧光法检出；长2～50μｍ,宽0 .5～1μｍ[5]；菌体呈多形性 ,因培养条件不同而有变化；军团菌是单核细胞和巨噬细胞的兼性细胞内寄生菌。2.2 本菌为需氧菌,但需要2.5%～5.0%CO2环境;最适温度为35℃～36℃,在25℃和40℃也可生长,但生长缓慢,固体培养基上一般在48h左右可见生长;不同培养基菌落形成和表现有所不同。本菌源自环境,在水源、土壤等自然环境中广为分布,人工培养极其困难,致使该菌迟至1977年才被发现。军团菌在BCYE培养基（以酵母浸出液作为蛋白质来源,再加入活性炭;焦磷酸铁的培养基,再加入缓冲剂N-2乙酰胺基-2胺基乙烷磺酸即为BCYE培养基[6]）上培养3～4ｄ可形成灰色菌落。本菌喜水,在蒸馏水中可存活2～4周,在自来水中可存活1年左右。2.3 军团菌的抗原构造分析证明其Ｏ抗原具有型特异性,藉此可将其分为41种菌型，63个血清型（SG）。军团菌病约90%的是由嗜肺军团菌所致,已发现15个血清型，其中以Lp1血清型最常见, Lp6次之[7,8]。我国已定型者有Lp1、Lp3、Lp5、Lp6、Lp9等。最近,基因水平研究表明,某些军团菌含有的巨噬细胞感染增强基因(mip)可调控24～27kD外膜蛋白的形成,这种蛋白可以使正常身强体壮的人患病。这使过去认为军团菌为条件致病菌的理论受到了极大冲击,这亦使这种可介气溶胶传播的呼吸道传染病变得日益恐怖；同时也可利用mip基因开发相关的PCR诊断技术。3 军团菌病发病机制本菌常从呼吸道侵入人体,也可从创面进入人体,人-人之间传播尚无充分证据。污染有此菌的气浴胶被人吸入后，可直接穿入呼吸性细支气管和肺泡，与吞噬细胞、中性粒细胞附着,并进入细胞进行繁衍,直到细胞破裂,产生一些淋巴与细胞毒性因子,引起肺损害。另外,军团菌还可直接产生释放各种毒素和酶,引起肺的持续性损害。如外毒素可溶解细胞[9];内毒素如脂多糖(LPS)能阻止吞噬体与溶酶体的融合;毒素类物质可损害单核-巨噬细胞的杀菌功能;磷脂酶可影响细胞内第二信使的形成, 从而抑制吞噬细胞的活化[10]。蛋白激酶能影响吞噬细胞的活化和杀菌功能[10];蛋白酶能灭活白细胞介素-2和裂解人Ｔ细胞表面CD4,从而干扰T细胞活化和功能的发挥。由嗜肺军团菌引起肺炎，以肺部感染为主,可合并肺外多系统受损的一种急性细菌性疾病；肺外感染多因肺炎过程中菌血症播散所致,多表现在胃肠道、肾脏、神经系统,少数病例可发生肝脏损害、心包炎、局灶性心肌炎、肛周脓肿、皮肤粘膜改变等[11] ；也可表现为无肺炎的急性自限性的流感样疾病——庞蒂亚克热(Pontiac fever)。[!--empirenews.page--]4 军团菌病的诊断4.1 诊断标准[12](试行)：①临床表现：发热、寒战、咳嗽、胸痛等呼吸道感染症状；②Ｘ线胸片具有炎性阴影；③呼吸道分泌物、痰、血或胸水在活性炭酵母浸液琼脂培养基(BCYE)或其它特殊培养基培养有军团菌生长；④呼吸道分泌物直接荧光法(DFA)检查阳性；⑤血间接荧光法(IFA)：查前后2次抗体滴度呈4倍或以上增高,达1∶128或以上；血试管凝集试验(TAT)：测前后2次抗体滴度呈4倍或以上增高,达1∶160或以上；微量凝集试验(MAA)：测前后2次抗体滴度呈4倍或以上增高,达1∶64或以上。凡具有1、2项,同时以具有3、4、5项中任何一项者,诊断为军团菌肺炎。4.2实验室诊断：4.2.1 染色法：气道分泌物革兰染色上,发现炎症细胞而无病因意义的病原体时,当怀疑可能为军团菌感染。作Himenes染色,如炎症细胞中染出红色杆菌,便可基本认定为本菌。另外,还可作Giemsa染色、镀银染色检查。缺点是其特异性不稳定，且需肺活检，对组织损伤大。另外,某些军团菌也呈抗酸染色阳性[13]。[1][2]下一页 4.2.2分离培养：病人唾液、痰、胸水、血液、气管抽吸物、尸检或活检组织以及环境因素如水、土壤等均可用于分离细菌。常用的培养基为BCYE，团菌在本培养基上菌落呈大小不一之乳白色,具独特之酸臭味；国内研制的以猪肺、绵羊血、L半胱氨酸和复合维生素B为主原料的培养基效果亦佳。 培养的缺陷性在于：(1)培养结果受标本采集质量、操作技术的影响,阳性率不一。 (2)费时较长,约7～10天。(3)培养基不易制作,技术要求高,价格较贵。(4)细菌的非培养状态,即活菌在培养基上不生长的情况可影响结果的判定。4.2.3 直接免疫荧光抗体法（DFA）：取呼吸道分泌物标本,用荧光素标记的抗军团菌抗体直接与标本作用后观察细菌形态,优点是简便、快速,2h内可出结果，特异性好；缺点是敏感性低，且只能用于Lp的检测。单克隆抗体应用于DFA与多价血清相比,特异性及敏感性均增高。 4.2.4 核酸探针技术：原位杂交技术能够特异性的检测到细菌,且可完整地保持组织细胞及细菌的形态,将原位杂交和聚焦激光扫描电镜技术结合将非常有助于检测细菌的空间及时间分布情况。[14]4.2.5 检测特异性抗体:感染军团菌主要产生特异性IgG和IgM抗体。血清IgG抗体出现晚,持续存在时间长。确诊病人时,采急性期和恢复期双份血清,恢复期抗体滴度升高达急性期4倍或以上,且滴度达1:128时判为阳性[6]。常用检测血清抗体的方法有：1、间接荧光抗体法； 2 、酶联免疫吸附试验；3 、微量凝集试验。4.2.6 尿抗原的检测：大多数军团病患者的尿液中有一种具有热稳定性及抗胰蛋白酶活性的抗原,血清中此抗原浓度比尿中低30～100倍,目前可采用单克隆或多克隆抗体的ＥＬＩＳＡ法对尿军团菌抗原进行检测,特异性、敏感性均很高，3h内可获得结果。缺点是由于尿抗原排出时间过长，无法确定是新近感染还是既往感染。4.2.7 PCR及其相关技术的应用：PCR与传统的实验室方法比较有着更高的灵敏度,如果实验过程操作严格、引物选择恰当,有着较好的特异性。PCR和探针杂交技术相结合,可在一定程度上提高检测的特异性和敏感性,但操作过于复杂繁琐。PCR与ELISA方法相结合检测军团菌,技术操作简单且节省时间。利用PCR技术不仅可以检测军团菌，还可以给其分型[15]。PCR技术操作过程中要特别注意两个问题：(1)要注意判定是否会有其它同军团菌种系相近的细菌得到非特异性扩增。(2)要注意防止交叉污染。[!--empirenews.page--]5 军团菌病的预防措施至今没有关于军团菌可以由人传染给人的报道,所以对军团菌病的预防应集中在控制军团菌污染源、控制气溶胶的形成、控制阿米巴等原虫的污染。对与人息息相关的且可能被军团菌污染的水源,如供水系统,要定期进行检查和消毒，防止军团菌在其中生长繁殖；有空调的室内要经常通风，减少室内环境被军团菌污染的可能；冷却塔和空调系统的管道和过滤部件要经常进行清洁。除此以外,根据监测数据,对供水和管道需要进行定期消毒,以杀灭军团菌及携带军团菌的原虫。消毒方法可采用常规的氯消毒法、臭氧消毒法、紫外消毒法、铜 银离子消毒法等。此外,高温可抑制或杀灭军团菌和原虫,当水温达到55℃以上时,也可有效控制军团菌的繁殖[16],因此对于小范围供水也可在短期采用提高温度供水法；对于水池、管道、水龙头、淋浴喷头可采用热水冲刷法。军团菌病以老年人、儿童、住院病人等免疫力较差的人居多,所以除了集中预防和控制措施外,个人预防也很重要,比如注意个人卫生、居室清洁通风(尤其是浴室和卫生间),以及进行体育锻炼,增强体质。还有要经常到空气清新的公园、绿地等处进行室外活动,这些地方空气中负离子浓度较高,负离子可增强人体巨噬细胞的吞噬功能等,提高人体的免疫力。此外,Dogasaki等[17]报道喝咖啡也对预防军团菌病有好处,发现咖啡提取物中含有的原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸对嗜肺军团菌有抗菌性。近年来,军团菌病在大中城市中的影响越来越大,这与人们越来越城市化的工作和生活