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光动力疗法进展与综述 08级药学2班 陈昌斌 1 引 言 光动力疗法可定义为这样一种操作：对身体遭受损害(常常但并不总是由于癌变)的病人系统的或者局部的施用一种被称作光敏剂的无毒药物或者染料，接着在一段时间后用可见光(通常是长波的红外光)直接照射受损部位，在氧存在的条件下，产生细胞毒物质，从而导致细胞死亡和组织凋亡[1]。在这里首先要区分三个基本概念：光疗(phototherapy)，光化学疗法(photochemotherapy)以及光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)。光疗是一种包含光诱导这种光化学现象的治疗方式，用于治疗各种疾病。光化学疗法是光疗的一种形式，除光之外还使用一种化学物质。而在光动力疗法中，联合使用了O2，光以及光敏剂。因此PDT既是光疗的一种形式，又是光化学疗法的一种形式[2]。 PDT是一种主要影响目标组织具有双重选择性的治疗方式。其双重选择性是基于光敏剂在正常组织和目标组织中浓度的差异，以及通过空间限制和聚焦的方式使光对目标组织直接照射。光敏剂在注射3-96小时后积聚在目标组织，具体时间取决于所用光敏剂。在积聚期间，用光直接照射目标组织以活化光敏剂，活化的光敏剂将能量传递给基态氧(3O2, 3∑g-)从而形成各种形式的活性氧，损伤细胞重要的结构和功能，进而导致组织的破坏[2, 3]。生物体系中光敏化的，氧依赖的反应称为光动力作用(photodynamic action)[4]。 光动力疗法这个概念源自于二十世纪早期工人们利用一些染料比如曙红与光结合治疗皮肤癌的实践[5]。血卟啉第一次被使用也是在这个时期[6]，直到二十世纪六十年代才出现关于卟啉在肿瘤细胞中选择性聚集以及暴露在可见光下症状恢复的零星报道[3]。现代对PDT兴趣的急剧增加源自于1960年Lipson和Baldes对血卟啉衍生物(HpD)的发现[4]，Dougherty等人在基础科学和临床应用方面的开创性研究大大推动了这一趋势[5-7]。Photofrin® (PF)即血卟啉的部分纯化制品是第一种在世界范围内很多国家(包括美国)获得正式批准用来治疗各种癌症的光敏剂。光动力疗法在临床癌症治疗中已取得了令人瞩目的成就，1993年加拿大卫生部门首先批准将PF应用于膀胱癌和食管癌的光动力治疗，到目前为止，光动力疗法在荷兰、法国、德国、日本和美国等国相继获得批准，还有11个欧洲国家正在寻求获得批准。2003年5月中国SFDA批准了这一治疗系统进入临床应用。光动力疗法已被公认为临床上除手术、放疗、化疗之外的第4种治疗癌症的方法[1, 2, 10]。 随着利用HpD-PDT治疗癌症经验的积累，人们认识到这个混合物有很多缺点，包括由于长时间的皮肤过敏迫使病人不得不在数周内避免日光照射，其对肿瘤细胞的选择性低于理想值，由于使用的光波长较短(630nm)使得光穿透肿瘤细胞的能力较差，而且事实上它是一个结构不确定的混合物[8, 9]。 近年来为了开发新的光敏剂人们做了很多工作，合成了数目众多的可用于PDT的潜在光敏剂，人们逐渐将重点放在那些易由丰富的天然前体，比如血红素以及叶绿素类化合物制备的光敏剂上。这样做主要是考虑经济和环境的因素。如果光敏剂比如卟啉通过全合成来制备，其产率通常很低，导致大量化学药品的浪费以及最终产品的高价格。如果光敏剂是一种天然化合物或者可通过简单的合成过程从天然前体制备，这些缺陷可被最小化[10]。 PDT中应用的大多数光敏剂都具有环状四吡咯结构，包括卟啉，二氢卟吩和细菌卟吩的取代衍生物(Fig. 1)。天然存在的叶绿素(Chl)和细菌叶绿素(BChl)类化合物分别是二氢卟吩和细菌卟吩的取代衍生物。命名叶绿素以及相关的二氢卟吩时，一般使用Fischer提出的俗名(trivial name) Fig. 1 卟啉，二氢卟吩以及细菌卟吩母环的结构。原子的编号方式与IUBAC-IUB的半系统编号体系 一致。粗线指出了这类化合物典型的具有18π电子的[18]-二氮杂轮烯芳香结构。 命名法，这些命名简洁而且在文献中应用非常广泛[11]。Fig. 1中显示的是IUBAC-IUB半系统编号体系的编号方式。叶绿素类母环为17, 18-二氢卟啉，而细菌叶绿素类则是7, 8, 17, 18-四氢卟啉，它们都具有典型的18π电子的[18]-二氮杂轮烯芳香结构[12, 13]。 2 光动力疗法的基本原理 2. 1 光物理学 Fig. 2中的图说明的是PDT所包含的光物理学过程[2, 14]。光敏剂的基态是单线态(S0)，有两个自旋方向相反的电子在能量较低的分子轨道。吸收适当波长的光之后(1)，光敏剂被激发到寿命较短(纳秒级)的第一激发单线态(S1)，两个电子中的一个被激发到能量较高的分子轨道，但是保持其自旋方向不变。光敏剂可以通过荧光(fluorescence)(2)或者内转换(internal conversion)(3)的形式发射出吸收的能量从而回到基态(S0)。也可以经历系间窜越(intersystem crossing)的过程藉此使激发态电子自旋方向反转以形成寿命相对较长(微秒级)的第一激发三线态(T1)(4)，其电子自旋方向相同。这种跃迁是自旋禁阻(spin-forbidden)的，但是一个优良的光敏剂仍然可以具有较高的 Fig. 2 Jablonski简图，PDT包含的光物理学过程：(1) 吸收；(2) 荧光；(3) 内转换；(4) 系间窜越； (5) 磷光；(6) T1态光敏剂将能量转移给三线态氧(3O2)生成单线态氧(1O2)。 三线态产率。处于T1态的光敏剂寿命很长，可以参与化学反应，比如(6)，因而光动力作用主要由T1态光敏剂介导。T1态光敏剂也可以通过发射磷光的形式回到基态(5)。 2. 2 光化学 处于激发三线态的光敏剂可以经历两种反应途径(Fig. 2)[15]，I型光反应历程是T1态的光敏剂直接和底物比如细胞膜或一个分子反应，转移一个质子或电子分别形成自由基阴离子或自由基阳离子，由此光敏剂通常回到基态，这些自由基可进一步与氧反应生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)。II型光反应历程(6)是T1态光敏剂与3O2之间电子自旋互换的过程。这个过程产生了具有细胞毒作用的第一激发单线态氧(1O2, 1Δg)，同时光敏剂回到基态。1O2被认为是PDT中产生光毒性的主要介质。I型反应和II型反应都可以导致细胞内生物分子的氧化，二者可以同时发生，其比例取决于所用光敏剂的类型，底物和氧的浓度。 I型反应途径往往包含由于三线态光敏剂的电子转移到分子氧导致的过氧阴离子形成的原初反应[16]。过氧化物在生物体系中的活性并不显著，并且其自身并不引发很大的氧化损伤，但它可以通过歧化反应生成过氧化氢和氧。过氧化氢在生物体系中很重要，因为它可以很容易的穿过细胞膜，而且不能被细胞排出。过氧化物对于高活性羟基自由基(HO·)的产生也具有重要意义。像H2O2一样，HO·也可以很容易的透过细胞膜，而且不能被细胞排出，这种高活性的自由基主要通过链式反应导致脂肪酸和其它脂类的氧化损伤。过氧化物还可以和羟基自由基反应形成单线态氧，或者与一氧化氮(NO－)(也是一个自由基)反应产生另一种高活性的氧化分子：过氧亚硝酸根(OONO－)。 这些活性氧，与经由II型反应途径产生的单线态氧一起，是可以直接与很多生物分子反应的氧化剂。由于单线态氧和羟基自由基的反应活性高而半衰期短，只有邻近它们产生区域(光敏剂定位区域)的分子和结构受到PDT的直接影响。这也意味着未与细胞结合的光敏剂不具有光毒性。在生物体系中单线态氧的半衰期小于40ns，因而单线态氧的作用半径大约是20nm。光损伤的位点取决于所用的光敏剂，因为不同的光敏剂积聚在细胞的不同部位，细胞膜是光动力损伤的重要靶点[1, 2, 10]。 2. 3 光敏剂在肿瘤组织中选择性积聚的机理 自从观测到血卟啉衍生物(HPD)定位于肿瘤中的能力以来，很多研究人员研究了光敏剂倾向优先定位于肿瘤以及其它特殊器官和解剖位点的机理。此外，关于光敏剂什么样的结构可使其对正常组织或器官中肿瘤部位的选择性达到最佳，人们进行了大量的研究[17]。事实证明这是一个非常复杂的问题，因为不同光敏剂其药代动力学可发生显著的变化。例如，一种光敏剂在开始使用后相对较早的时间点比如3小时，可以达到最好的肿瘤—正常组织比，而换成另一个光敏剂，肿瘤—正常组织比达到最佳的时间则变为注射后7天。相对于其肿瘤定位性质，这些四吡咯类化合物一个很特殊的性质是它们牢固结合血浆蛋白以及发生自聚集的倾向。这意味着大多数光敏剂注射入血管后表现为大分子的形式，原因是它们或多或少的与大蛋白分子牢固结合，或者形成与大蛋白分子类似大小的分子间聚集体。很多研究人员报道了当光敏剂在体外与血浆混合后它在各种不同类型血浆蛋白之间的分布情况。这些蛋白通常分为四个部分：白蛋白和其它巨大蛋白，HDL，LDL以及VLDL。然而，大多数亲脂性光敏剂不溶于水介质，必须通过混合溶剂交付，而混合溶剂可能改变光敏剂在血浆蛋白中的分布，这个事实使得光敏剂分布研究变得复杂化。尽管关于优先结合LDL的光敏剂是更好的肿瘤定位器的观点还存在争议，但这却是不争的事实[18, 19]。 有必要区分选择性定位和选择性滞留这两个概念。代谢较快的光敏剂其肿瘤定位性质主要是由于在肿瘤中的选择性积聚，而代谢较慢的光敏剂主要通过选择性滞留达到定位的目的。在选择性积聚模式中，一般认为肿瘤新生血管对大分子的通透性增加，这是导致光敏剂优先溢出的主要因素。这些快速作用的光敏剂常常结合白蛋白，而白蛋白具有理想的大小和Stokes半径，使其容易通过肿瘤微脉管内皮上的孔隙。光敏剂在肿瘤中的滞留一直是很多研究的主题，如前所述，一种流行的理论认为，光敏剂与LDL的结合是非常重要的[18]。该理论提出，癌细胞过度表达LDL(apoB/E)受体。LDL受体表达的上调是迅速生长的恶性细胞获取脂质生物合成必需胆固醇的一种方式，而脂质是细胞膜快速更新所必需的物质。为了说明光敏剂在肿瘤组织中的选择性滞留也提出了其它的理论。其中一个理论认为肿瘤缺乏完备的淋巴排泄系统，从高渗透性的肿瘤新生血管中溢出的大分子滞留在血管外空间。另一个理论涉及到能不同程度渗入固态瘤的巨噬细胞。肿瘤相关的巨噬细胞积聚某些光敏剂的量可达肿瘤细胞积聚量的13倍之多。这个理论可以解释为巨噬细胞对光敏剂聚集体的吞噬作用，或者巨噬细胞优先摄取由于卟啉的结合发生了改变的脂蛋白。还有一个理论认为肿瘤中通常较低的pH值对诱捕某些阴离子光敏剂具有影响，这些阴离子光敏剂在正常生理pH值时可发生电离，当它们处于肿瘤中较低的pH环境时变为中性价态，因此亲脂性增加。目前一个新的理论认为光敏剂在组织中的积聚与关节组织积聚脂质微滴的特性类似。位于线粒体膜内部的外围苯并二氮受体负责结合某些积聚在线粒体上的卟啉类光敏剂。还有的认为正常细胞和癌细胞线粒体膜电压的差异对光敏剂在肿瘤中的积聚具有重要影响[10, 19]。 2. 4 PDT导致的肿瘤破坏模式 PDT的抗肿瘤作用主要由三种机理引发[19, 20]。首先，强烈的抗脉管作用可导致血栓形成以及肿瘤血管出血，进而导致肿瘤由于缺乏氧以及营养物质而死亡。其次，如果光敏剂可直接进入肿瘤细胞，可以发生由于凋亡或者坏死导致的肿瘤细胞直接死亡。坏死是由于细胞的重大损害导致的变性的细胞死亡。凋亡是指生理以及病理条件下，活的有机体衰老细胞的遗传性程序死亡的机制。最后，由于PDT诱导产生的严重炎症，细胞活素的释放以及应激反应蛋白的产生可以导致白血球流入到肿瘤中，这一方面可以直接导致肿瘤细胞破坏，另一方面还可以刺激免疫系统识别并摧毁肿瘤细胞，这有助于PDT治疗的长期成功以及靶点区域以外肿瘤细胞的破坏。 3 光动力疗法中的光 3. 1 组织的光学窗