植物细胞工程的笔记-原版.doc

绪论 1生物技术：以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官，组织，细胞的特性和功能，设计和构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合体系。内涵：运用生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质。 2细胞工程：是以细胞学，遗传学，发育学及分子生物学等理论为基础，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究和改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞，细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的科学。 3植物细胞工程：以植物组织和细胞为基本单位，在离体条件下进行培养，繁殖，或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，以获得有用无知的过程。 4细胞全能性：高等植物的组织和器官可以不断分割，直到单个细胞，如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个体。 （一个生活细胞所具有完整生物个体的潜在能力） 5植物细胞的工程类别 培养层次：植株培养。器官培养，胚胎培养，愈伤组织，细胞培养，原生质体培养（原生质体：植物细胞脱除细胞壁后的完整细胞培养。） 6应用：在植物育种上(1快速获得特殊倍性材料，2克服远缘杂交不亲和，3克服杂交种胚早期夭折，4导入外源基因，5突变体筛选，6种质资源保存），种苗脱毒和快速繁殖，细胞培养生产有用的次生代谢产物，在细胞学说和发育生物学研究中，在植物遗传，生理生化以及病理等基础研究中的应用 7 植物组织培养 动物组织培养 细胞全能性 细胞增殖 固体培养基 液体培养基 蔗糖，植物激素 葡萄糖，动物血清 植物体 细胞株，细胞系 快速繁殖，培育无毒植株 获得细胞或细胞产物 第一章 1生活细胞的全能性必须首先回复到分生状态或胚性细胞状态，（条件：离体，适当的刺激） 2植物细胞分类：第一类，茎尖，根尖，及形成层细胞，这类细胞始终保存分裂能力，从一个周期到另一个周期，称为周期细胞，第二类，筛管，导管和气孔保卫细胞等特化细胞，为永久失去分裂能力的细胞，为终端分化细胞，第三类，表皮细胞及各种薄壁细胞，在通常情况下不分裂，但受到外界刺激后从新启动分裂，为G0细胞。 高度分化的细胞表现细胞全能性的能力降低或丧失， 2细胞的脱分化：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。（静止细胞启动分裂都是分化细胞成功脱分化的重要标志，静止细胞：停止分裂，执行特定的代谢功能） 3脱分化过程的生理活动与细胞结构的变化：细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加，液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要标志。变化最明显的叶绿体 4脱分化的过程：（1）启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现，（2）演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原生质体，（3） 脱分化终结期，细胞回复到分生细胞的阶段，细胞分裂即将开始。 5植物激素是离体培养中所必须的条件，因此与激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。 6细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育过程，（一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能，这是在时间上的分化，同一种细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态和机能，是空间上的分化）本质是基因表达和调控的结果 7再分化，在离体的条件下，当细胞脱分化以后无序生长的细胞及愈伤组织要重新进入有序生长才能成为新个体。基因选择性表达与修饰的人工调控过程。 8极性：植物的器官，组织甚至单个细胞在不同轴向上存在的某种形态结构及生理生化上的梯度差异，无论低等植物或高等植物都存在。细胞的不均等分裂时细胞极性建立的标志。极性建立与质膜离子通道的不对称分布和细胞周质微管的重排有关。 9管状分子（TE）由愈伤组织薄壁细胞分化形成，是愈伤组织细胞分化器官的前提，离体培养中TE的出现时组织分化的标志，分为三个阶段，叶肉细胞的脱分化，脱分化叶肉细胞向TE细胞转换，TE细胞特化阶段 10激素对细胞生长与分化的调控是一个复杂的级联调控过程。 11在离体培养条件下，植物细胞经过再分化形成完整的个体通过两天途径：器官发生和体细胞胚发生 第二节 1器官发生：在培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织)分化形成不定根或不定芽等器官的过程。 离体培养下器官发生的难易，往往取决于研究对象的培养技术成熟程度及其调控机制基础研究的深度。 2离体培养中器官发生的方式:1先形成芽，后在芽上形成根，2先形成根，后在根上形成芽，3在愈伤组织的不同部位形成芽和根再通过维管束组织的联系形成完整的植株 4经过愈伤组织再分化器官的过程：1外植体经过诱导形成愈伤组织，2形成生长中心，也即愈伤组织形成器官的部位，3器官原基及器官形成 不经过愈伤组织的器官发生：1外植体已经存在器官原基，2外植体某些部位的细胞重新分裂后形成分生细胞团，再由分生细胞团形成器官原基 5起始材料对器官分化的影响：母体植物的遗传物质（器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异），外植体类型及生理状态（外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，有时甚至影响分化程度和器官类型。 6离体培养下器官分化，在大多数情况下时通过外源提供适宜的植物激素实现的，生长素与与细胞分裂素占主导地位。 7光照时间，强度及光质对器官分化均有影响 第三节 ： 1 合子胚 体细胞胚 萌芽率高，质量好 萌芽率低，质量差 受精卵 体细胞 胚柄，明显 即使有也不明显 形态固定，体积较小 形态复杂，体积较大 变异率低 变异率高 2体细胞的界定：其一：体细胞胚是离体培养的产物，只限与离体培养范围内使用，以区别无融合生殖胚，其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别合子胚，其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径 3体细胞的形成 外植体直接发生，经过愈伤组织的体细胞胚发生，细胞悬浮液培养的体细胞胚胎发生， 4与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株的特点:体细胞具有双极性，体细胞胚形成后与母体的维管束系统联系较少，即出现生殖隔离现象 5影响体细胞胚发生的因素：（1）外缘激素（生长素对体细胞胚发生有重要的调控，细胞分裂素对维持在促进细胞分裂和维持细胞活跃生长中有重要作用）（2） 培养基：（3）不同基因型间体细胞胚形成能力的差异，（4）外植体类型，采用幼胚，成熟胚，上胚轴和子叶为外植体，较容易产生胚性愈伤组织，而采用叶片，茎段等能形成体细胞胚 6体细胞胚胎发生的生化与分子基础：内源激素的变化，特异蛋白质，基因表达调控 第二章 1体细胞无性系:任何形式的细胞培养所产生的植株，而这些植株所表现的变异称为体细胞无性系 2离体培养下的稳定性，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性，即使发生变异也可淘汰变异，也可以通过离体培养选择保留并稳定下来 3离体培养下的遗传变异的特点 普遍性，局限性，嵌合性 4影响体细胞遗传与变异的因素 供体植物(二倍体比单倍体的稳定)，培养基和培养方式，继代培养的次数（时间越久次数越多，则变异频率越高， 5体细胞变异的细胞遗传学基础：DNA核内重复负责，染色体断裂与重组，非正常的有丝分裂 6体细胞变异的分子遗传学基础：碱基突变，DNA序列的选择性扩增与丢失，转座子的活化，DNA甲基化 7离体培养诱导筛选体细胞无性系变异的优点，（1）由于筛选可以在离体培养下，从而可以在晓空间内对大量个体进行选择，（2）细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内部完成，且不受季节限制，因此筛选效率高，（3）诱变和筛选的条件可控制，从而提高重复性，（4）由于变异是在单细胞水平上进行的，因此一个突变体就是来自一个细胞，不会有非突变体细胞的干扰，避免整体植株水平上无性变异常呈现嵌合体，因而可以省去变异分离的麻烦，（5）理化诱变剂可较均匀地接触细胞，有较高的频率发生突变，增加选择的机会 8（1）体细胞变异诱导材料的选择：注意的问题，目标性状的可行性，必须充分考虑实验植物的细胞培养的技术水平，适当的细胞类型 （2） 培养细胞的自发变异（3）培养细胞的诱变（物理诱变，化学诱变，复合因子诱变，转座子插入诱变，）（4）体细胞突变体的筛选（直接筛选法和间接筛选法） 9体细胞无性系变异的利用：创造育种中间材料或直接筛选新品种，基因克隆及功能鉴定，发育生物学研究，生化代谢途径研究 第三章 植物细胞工程技术原理 1实验室：3个基本需要（实验准备，无菌操作和控制培养） 2洗涤：铬酸洗涤液是强氧化剂，去污能力很强，特别是在加热后去污效果更好，一般可在，40到45摄氏度使用，但铬酸洗涤液同时具有较强的腐蚀性，使用时要小心谨慎，以免发生意外，仅用于玻璃实验器皿，可反复使用，直至溶液呈青褐色为止。 洗涤方法，1玻璃器皿：新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用1%HCl溶液浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗1到两次，干燥后即可使用。已经使用过的试管，烧杯，三角瓶，将器皿中的残留除去，用清水洗净，再用合成洗涤剂洗刷，用清水洗干净后，最后用蒸馏水冲洗1到2次，，内径狭小的玻璃制品，先放入铬酸洗涤液中浸泡2h以上，经流水冲洗半个小时，再用蒸馏水冲洗1到二次，然后烘干，或晾干，载玻片或盖玻片，先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几个小时，或者是用铬酸洗涤液煮沸半个小时，取出后用清水冲洗干净，将其贮藏在95%的酒精中， 2塑料品洗涤：用合成洗涤剂，冲洗必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗 3金属用品，用酒精擦拭，不要洗涤剂，并保持干燥 3灭菌技术：灭菌是指杀灭培养物，培养基，培养用具及培养环境的杂菌，是防止微生物污染的最重要最基本的环节，物理方法，利用高温，射线等杀死微生物或通过过滤，离心沉淀等去除微生物，化学方法，使用消毒剂抗生素杀灭微生物 (1) 高压蒸汽灭菌：蒸馏水，各种器械，棉塞，1灭菌锅可装满，2锅内的冷空气排尽，3严格遵守保持压力的时间，20min 121摄氏度 (2) 过滤灭菌：用于易于分解而失效的某些化合物质，液体培养基和化学试剂 (3) 湿热和干热灭菌，湿热，玻璃，培养基，干热，玻璃器皿，金属，160摄氏度到180摄氏度，恒温40min，或120摄氏度灭菌2小时 （4）熏蒸，熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，乙二醇，主要用于接种室和培养室灭菌，（5）药剂灭菌：70%到75%酒精，0.1%到0.2%氧化汞，10%的次氯酸钠，主要用于培养材料的表面灭菌，（外植体） 培养材料的灭菌原则，（重要）既要达到灭菌的目的，又不伤害组织和细胞 （6） 灼烧灭菌，外焰，接种器械，瓶口，棉塞，包扎纸，瓶盖 （7）紫外线照射，接种室空气和台面，花粉，15到20min 4培养基：植物细胞，组织器官吸取各种营养产所的地方，包括水分和各种营养物质。 培养基的配方是决定培养物能否正常生长或者能否达到培养目的的首要前提。 成分：无机盐，有机化合物，生长调节剂（基本培养基部含有生长调节剂） （1）无机盐，大量元素（C，H,O，N，P，K，Na，Ca，Mg，S）每升几十至几千毫克， 微量元素（铁，通，锌，硼，锰，钴）10的-5次到-7次 （2）有机化合物：基本培养基质只含有无机盐类 作为碳源利用蔗糖，葡萄糖，果糖，，做为