植物细胞工程知识点.doc

绪论： 细胞工程(cell engineering)：应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义：所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。狭义：细胞融合和细胞培养技术。 细胞学说：细胞是生物结构、功能和发育的基本单位。 l 1902，Haberlandt 《植物细胞离体培养实验》；B族维生素的应用：White等；激动素的发现：Miller；单个胡萝卜细胞形成体细胞胚：1958，Steward；最早研究茎尖培养人参：罗士韦。 植物细胞工程技术在育种上的应用（简答）：1、快速获得特殊倍性材料：单倍体、三倍体2、克服远缘杂交不亲和性3、克服杂种胚早期夭折4、导入外源基因5、突变体筛选6、种质资源保存 l 植物胚胎干细胞：茎端分生细胞、形成层分生细胞和薄壁细胞；组织干细胞：分化程度高的一些细胞；脱分化（dedifferentiation): 分化细胞转变为分生状态，形成胚性细胞团或愈伤组织的现象；脱分化条件：创伤和外源激素 第一章 ： 分化（differentiation）：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 脱分化（dedifferentiation): 培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。 再分化（redifferentiation）：离体条件下，细胞脱分化后，无序生长的细胞及其愈伤组织重新进入有序生长再生为个体的过程 细胞全能性（cell totipotency）：一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力。 全能性差异：植物顶端分生组织细胞较强；完全失去分裂能力的细胞，如细胞核开始解体的筛管和木质部部分没有。 l 细胞脱分化过程中的生理活动与细胞结构变化：1、细胞质显著变浓，大液泡消失；2、核体积增加并逐渐移位至细胞中央3、细胞器增加4、其中细胞脱分化的重要特征：液泡蛋白体的出现，质体转变为原质体5、细胞开始脱分化的标志：蛋白体的出现，同时细胞质密度增加。 （填空）极性（polarity）是植物细胞分化中一个基本现象；细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志；极性生长的重要原因是细胞内不同方向Ca+梯度分布；植物细胞离体培养再生两条途径是器官发生体和细胞胚胎发生 离体培养中器官发生的方式：1、先芽后根，较为普遍；2、先根后芽；3、愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。 激素对器官分化的调控：IAA与KT比例高时利于根的形成，低时利于芽的形成；植物多肽PSK可极大加强基本激素的作用效果。 体细胞胚的形成：1、从外植体上直接发生。2、经过愈伤组织：诱导形成愈伤组织；胚性化；体细胞胚形成。高浓度2,4-D可诱导愈伤组织产生；转到低浓度使胚性化。3、细胞悬浮培养的体细胞胚发生；胚性细胞团：成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞。 体细胞胚与合子胚的不同：1、合子胚发育初期有明显的胚柄，体细胞胚只有类似胚柄的结构；2、子叶不规范；3、体积小；4、干物质含量低；5、含水量高；6、没有休眠 第二章 ： 体细胞无性系变异（Somaclonal variation）：经过组织培养循环出现的再生植株变异。 组织培养是诱导的主要原因。1、体细胞再生植株的变异；2、花粉植株的无性系变异 诱变方式：体细胞人工突变、基因转移、体细胞融合、物理诱变（紫外线、X射线等）和化学诱变（DES、EMS等） 嵌合体(mosaic)：同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞 体细胞无性系变异的特点（简答）：1、体细胞无性系变异是组培中较普遍现象2、体细胞无性系变异可遗传3、体细胞无性系变异频率显著高于自然突变4、体细胞无性系变异与外植体来源及培养时间有关 （填空）分化水平高的组织产生的无性系比分生组织产生的更易变异。 获得较高频率的体细胞无性系变异：以分化程度高的组织或细胞为外植体，在一定植物激素浓度下诱导愈伤，并经较长时间的继代培养，然后诱导分化再生植株，有可能得到较高频率的体细胞无性系变异。 l 体细胞变异的细胞遗传学基础（论述）： 染色体变异：非整倍体；染色体断裂、缺失、易位、基因重复和突变 植物组织和细胞进入离体培养环境后，细胞分裂的不规则性显著增加，导致染色体和 分子水平的变异。最常见是染色体数目变化。 离体培养细胞染色体易于断裂原因：细胞离体培养时分裂周期缩短，分裂速度加快，异染色质复制落后于真染色质，形成染色体桥，造成染色体断裂。 l 离体培养细胞异常有丝分裂类型：1、有丝分裂失败或进行无丝分裂2、核内有丝分裂：染色体复制而细胞不分裂3、核内再复制：DNA复制而染色体不复制4、有丝分裂时形成多极纺锤体。 转座子活化的影响：1、转座子活化可造成基因表达的广泛变化，因此无性系变异频率才如此之高2、转座子具有使不活动的结构基因活化特点，因此会有显性基因3、转座子还可使多拷贝基因中那些不表达的拷贝活化，提高基因表达的强度，即基因放大。 单倍体培养细胞的无性系变异筛选抗性突变细胞株具有高效和容易稳定优越性：隐性突变基因可以表达，大大提高选出抗性细胞株的机率；显著加快了突变体的稳定和纯合过程。 第三章 ： 器皿的选择与清洗：不同规格三角瓶；清洗：自来水洗，烘干，泡酸，自来水洗，去离子水洗，三蒸水洗，烘干（培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。酸液（洗液）：浓硫酸加重铬酸钾） 母液的配制：1、大量元素母液：通常配成10×浓缩液，配1L培养基时加100mL注意：配制时加一个溶解一个，最后加钙2、微量元素母液：通常配成1000×浓缩液，配1L培养基时加1mL3、铁盐母液：通常配成100×浓缩液，配1L培养基时加10mL，螯合铁使得培养基pH升高至6～8时，铁离子仍保持二价，可被很好地吸收利用 过滤消毒方式：0.45或0.22μm微孔滤膜进行过滤，如激素、诱导子等 复合灭菌：在充分清洗后（通常流水冲洗几小时），75％酒精灭菌0.5min，0.1%升汞灭菌5～20min，消毒剂灭菌后一定要用无菌水充分清洗 灭菌方式：1、高压灭菌2、干热灭菌3、过滤灭菌4、药剂灭菌5、火焰灭菌6、熏蒸灭菌：KMnO4+HCHO 实验室灭菌7、紫外灭菌：无菌间及安全柜灭菌 激素（脱落酸）：组培中主要用于胚胎或胚状体发育的后期，抑制胚胎的过早萌发，促进胚胎成熟，使胚胎长成形态正常的植株 生长素分裂素使用原则：较高浓度的生长素单独或与细胞分裂素结合使用可有效刺激培养细胞的增殖和连续生长，形成愈伤组织。培养基中KT浓度高于IAA浓度时，培养物形成芽，不形成根；两者浓度大致相等时，只诱导愈伤组织发生，基本没有器官发生；当IAA浓度高于KT时，培养物分化出根，不形成芽。 体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis)：从植物体细胞培养物中分化胚胎或胚状体的过程。 第四章 快繁（rapid propagation）或微繁（micropropagation）技术：利用组培进行快速营养繁殖的技术 快繁的应用价值：1、杂合植物材料的大量繁殖。2、脱毒种苗生产3、加速繁殖数量有限的特殊种质材料4、单独繁殖雄株或雌株 l 外植体褐变brooming：褐变原因:植物中含有多酚，创伤会激活多酚氧化酶，将多酚氧化为棕褐色的醌类，使得外植体切口发生褐变，并渗透入培养基，严重影响培养物的生长和分化，甚至致其死亡。影响褐变因素：木本植物外植体易褐化，尤其成年树；培养基中过高浓度的无机盐和肌醇会加剧褐变；6-BA和KT有诱导褐化作用；强光和高温会促进褐化。预防褐变：1、选取酚类含量低的实验材料2、选择无机盐含量低，不加肌醇的培养基3、在弱光线或黑暗条件下培养4、培养基中加入抗氧化剂：Vc、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。5、在培养基中加入0.5%~1%活性炭，吸附醌类，注意同时提高培养基中激素浓度。6、不断地更换新培养基 再生植株方式：1、外植体直接产生不定芽2、外植体产生愈伤，转移培养后产生胚状体，再生植株3、外植体产生愈伤，转移培养后分化芽，再生植株。 不定芽adventious shoot：顶芽和腋芽以外任何其它器官或组织产生的芽 l 组培脱毒方法：1、高温脱毒：病毒和植物细胞对高温耐受力不同。热处理脱毒又称为温热疗法，分温汤浸渍处理和热风处理两种。2、低温脱毒也称冷冻法3、化学法：2-硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、virazole（病毒唑）和一些蛋白质与核酸合成的抑制剂， 植物病毒鉴定方法：1、指示植物法2、抗血清鉴定法3、酶联免疫法4、电镜检查法5、RT-PCR （填空）1、朱至清发现低铵离子浓度和过滤消毒的单糖显著促进禾谷类花粉胚的发育，建立了N6和改良N6培养基2、欧阳俊闻确立单核中期的小麦花粉最适于产生花粉植株，较高的培养温度有利于花粉绿苗形成3、卫志明首次指出大麦遭受碳饥饿可大幅度提高花粉胚的产率。4、孙敬三发现花粉中质体DNA降解引起的质体RNA和蛋白质的匮乏是白化苗形成的原因。5、烟草“单育一号” 水稻“单丰一号”。 单核中晚期至双核早期的花粉最易形成花粉胚或花粉愈伤 条件培养基：已经预先培养过花药（或其它离体细胞）的液体培养基 游离小孢子培养（isolated microspore culture），又花粉培养（pollen culture）：把小孢子从花药中分离出来，进行人工培养 小孢子分离培养方法：挤压法、散落法和器械法 单倍体植株：植物学上通常把具有配子体染色体数目的孢子体叫做单倍体植株 单倍体植物在遗传育种上的价值（简答）：1、利用单倍体植物控制杂种分离，加快常规育种速度2、提高常规育种的选择效率3、利用H系进行基因定位，绘制遗传图 心形胚以后的双子叶胚较易培养，球形胚很难培养；ABA可抑制幼胚吸水，使其脱水干燥，发育成熟 胚胎拯救：种间或属间杂交时，两个基因组表达不协调，多数情况下胚乳最先败育，胚仍然健康，可通过离体胚培养将杂种幼胚培养成植株，称为胚胎拯救 胚乳培养的意义：1、胚乳细胞中储存大量淀粉、蛋白质和脂类，是研究这些产物代谢工程的理想系统2、完全由薄壁细胞组成的均质组织，是实验形态发生学研究的极好材料。3、胚乳植株－三倍体，高产、优质、果实无籽；三倍体的经济价值：无籽果实；生物量高；品质好；获得三体以进行基因定位。 第五章 悬浮培养Cell suspension culture: 将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术 悬浮细胞系：1、悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。2、均一性好：细胞形状和细胞团大小大致相同。3、生长迅速 悬浮培养细胞的同步化：1、分选法：梯度离心；Ficoll；流式细胞仪2、饥饿法3、抑制剂法 FdU，HU4、低温处理：低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的培养温度，也可达到部分同步化。 看护培养（nurse culture)：在固体培养基上置入一块活跃的愈伤组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸润湿后将细胞接种于滤纸上，当培养细胞长出微小细胞团以后，将其肢解转至琼脂培养基上让其迅速生长 次生代谢产物secondary motabalate：由初生代谢产物经过一些独特的代谢途径派生出来的小分子化合物 意义：植物次生代谢产物一直是药物和工业原料的重要来源。在保持植物抗逆性、抗病性和抗虫性及担当信号分子方面起重要作用。 植物细胞培养的优势：可摆脱对植物资源的依赖，保护物种多样性和生态环境 药用植物细胞培养步骤：1、诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系2、筛选高产细胞系3、生物反应器中大量培养细胞或细胞团 二步法培养：第一步，愈伤培养在生长培养基上使细胞快速增殖。第二步，细胞生长通过指数生长期后，转移到生产培养基上进行第二步培养，以获得最高次生产物产量。 诱导子（elicitor)：一类能引起植物细胞代谢强度改变或