斑马鱼的软骨发育及其矿化过程.doc

清华大学毕业设计论文 摘要 斑马鱼，作为发育生物学研究的最佳脊椎动物模型，为人类的相关研究提供了重要的参考依据。本文主要讨论了斑马鱼幼体的软骨，特别是脊椎软骨的发育过程及其软骨的超微结构特点。为转基因、基因突变鱼类的研究提供了对比依据。 本文主要讨论了斑马鱼脊椎软骨的发育进程，以及软骨细胞特别是脊索旁软骨的排列，形貌，大小及其显微结构特点和中胚层分化的显微形貌。 斑马鱼脊椎软骨在配卵后2～3天开始发育，围绕在脊索周围，并逐渐向神经管和血管方向延伸。斑马鱼脊椎软骨沿体节发育，腹部以前的体节在6天已基本分化为软骨细胞，并且随着时间的推移，沿体节向尾部方向的生骨节逐步分化为软骨细胞，在1个半月左右的时间，软骨组织的分化基本完成。斑马鱼的软骨组织排列整齐，大多数细胞大小在5－20μm范围内。斑马鱼的软骨组织为透明软骨，胶原纤维为II型胶原，没有典型的周期结构，含量很少。 在TEM的观察中发现，斑马鱼的肌肉组织分化较早，在3天已基本分化完成。而体干部的脊索旁仍为中胚层的间叶细胞，为软骨细胞的原基，在分化成软骨细胞的过程中，首先是在形状和排列上趋于整齐和规则。斑马鱼的骨化方式为软骨骨化。软骨细胞的细胞质中富含大量的线粒体和内质网。在细胞质中还有大量直径为100-400nm的囊泡，紧密排列在一起，起传输物质的作用。此外，脊髓处的细胞，其细胞核较大，细胞质很少，有别于软骨细胞。并且该处细胞有部分已死亡，被其它细胞所代替。 关键词：软骨细胞，发育，显微结构 Abstract Zebrafish provides an important referenced foundation for the relative research as the best pattern of vertebrate in developing biology. In this paper the process of development and the ultrastructure of the cartilage especially the parachordal cartilage in zebrafish larva are investigated . And that supply the contradistinctive basis for the research about transgenic and gene mutation fishes. Here we investigate the developing process of parachordal cartilage and chondrocyte arrangements,shapes ,size,and ultrastrcture . In zebrafish parachordal cartilage begin to form at 2-3 days postfertilization ,and surround the notochord and extend gradually to spinal cord and dorsal aorta. Parachordal cartilage develop along somite and at 6 days postfertilization the somite before venter have differentiated and all accomplish differentation on the whole about at one and a half month postfertilization .The chontrocytes arrange regular .The size of chontrocytes is between 5-20μm mostly. In zebrafish the cartilage is hyaline cartilage and the collagen fibrils is predominantly II type fibrils. And that are relatively thin and do not display the characteristic 67nm banding. We discovered that the differentiation of musculature is more earlier than cartilage by TEM and that accomplished basically at 3 days postfertilization. During the differentiation of cartilage the shape and arrangement of mesenchymal cell in mesoblast go to orderliness and regular gradually at first. With the electron microscope ,the active cartilage cell is seen to contain numerous slick endoplasmic reticulum,mitochondria and vesicles which arrange together in order and the diameter of these vesicles is about 100-400nm, transmitting the substance. Furthermore, the nucleolus of spinal cord cells is more larger and we also can observe that some cells have dead. Keywords : cartilage ,development, ultrastrcture 第一章. 前言 由于软骨细胞所致的成骨活动发生较早，所以对斑马鱼软骨发育的研究在骨损伤修复过程中对骨力学功能恢复有较大意义。 同时，认识软骨组织的发育过程及其形貌特点，对于认识生物矿化的过程和机制有很大的辅助意义。 生物矿化本质上是一个受基因精确表达与调控的过程，因此研究矿化基质蛋白的基因位点和基因表达调制的细节，研究基因调控下的生物矿化过程将是搞清矿化控制机理的根本解决途径。从分子水平上研究软骨、骨的发育及矿化机制不仅使我们的认识更深入，同时对于骨的损伤修复及仿生材料的制备有很大的指导意义。 关于斑马鱼脊椎软骨的发育过程的研究报道很少。斑马鱼脊椎软骨发育的开始时期约为配卵后2- 3天左右，主要集中在体节的前端。目前，关于脊椎软骨的形貌观察主要在组织水平上，未有从分子水平上的进一步研究。所以搞清斑马鱼脊椎软骨的发育进程和显微结构是研究转基因和基因突变斑马鱼软骨结构变化的基础和前提，为从分子水平上的进一步研究提供了重要的对比依据。 第二章．文献综述 §1.硬骨鱼的胚胎发育 §1.1 卵裂、囊胚及原肠胚的形成 §1.1.1 卵裂 卵受精后发生卵质分离，使细胞质与卵黄明显分开，细胞质集中于动物极形成一帽状的胚盘，后者与围于卵黄四周一层很薄的称为卵黄细胞质层（yolk cytoplasm layer）的细胞质相连。 图2-1 卵裂为盘状卵裂。第一次卵裂的分裂沟自动物极向下但不达到胚盘的底面，因此在胚盘底部还有一薄层细胞质（细胞质间桥）使分裂球彼此相连。第二次卵裂则与第一次卵裂相互垂直，形成大小相似的4个细胞。第三次卵裂有两个卵裂面，都与第一次平行，结果形成4排，每排为4个分裂球的16个细胞。这三次卵裂的分裂沟与第一次一样都达不到胚盘底面，因此分裂球之间在底部仍通过细胞质间桥彼此相连。从第五次分裂起，卵裂面渐渐不整齐，细胞大小也不一样。 有的鱼类从第五次卵裂时，中央几个分裂球成切线裂，即分裂面与胚盘表面平行，将分裂球分为上下两层，上层分裂球为完整的细胞，下层分裂球的底部仍旧没有质膜包围，通过细胞质间桥与相邻的分裂球以及与卵黄细胞质层相连。在斑马鱼，第五次卵裂后只有胚盘边缘的细胞通过细胞质间桥与卵黄细胞质层相连，直到第十次卵裂都是这种情况。位于胚盘下面的腔称为胚盘下腔（subgerminal cavity）。 §1.1.2 囊胚 随着卵裂的不断进行，胚盘分裂球数量日益增多，称为被膜层，它是一连续的细胞层，细胞排列较为紧密，其边缘附着于表胚层上；另一部分位于被膜层下，为一群疏松的细胞团，称为深层细胞。在深层细胞与卵黄之间的空腔称为囊胚腔。在胚盘下面卵黄表面为一层非细胞层（也即最早位于卵黄四周的卵黄细胞质层）称为表胚层或卵黄融合层（yolk syncytical layer），因为它有许多核但无质膜相间隔，所以又称为卵黄多核体。表胚层可分为内表胚层和外表胚层：前者指位于胚盘下的部分；后者指位于与胚盘四周相连部分。外表胚层向外与包在卵黄外的卵黄细胞质层相连。 表胚层的形成过程，在斑马鱼已经研究清楚，它是在第九次卵裂后开始形成，在第十次卵裂结束时完成。第九次卵裂后与卵黄细胞质层相连的胚盘的边缘细胞界限逐渐消失，边缘细胞似乎倒坍到卵黄细胞层中，致使此层明显加厚。边缘细胞的细胞核通过有丝分裂不断增加核的数量，而形成卵黄多核体，就这样形成了表胚层。表胚层的主要作用有三：将消化卵黄的物质传递到分裂腔（囊胚腔），然后被分裂球利用；作为胚盘和卵黄之间的过渡地区；作为原肠作用时胚环的细胞外包扩展的附着基质。 §1.1.3 原肠胚的形成 硬骨鱼原肠作用最明显的特点是外包和集中。斑马鱼囊胚时胚盘也是由被膜层细胞和深层细胞组成。原肠作用开始时，与外包的同时，胚盘边缘的深层细胞发生内卷，由于这种内卷作用使胚盘分为上胚层（将来成为胚胎的外胚层）和下胚层（将来成为胚胎的中胚层和内胚层）。在深层细胞发生内卷的同时，上、下胚层细胞向原肠胚的背部集中和伸展而形成胚盾。 胚环形成后可分为上、下两层：上胚层和下胚层。上胚层包在卵黄之外，形成卵黄囊的外胚层和中胚层；下胚层细胞则不断向胚盾集中，形成正在不断增长的胚胎的中胚层，这点与两栖类和鸟类胚孔形成时的形态发生运动是不同的。 胚盘外包首先是由于外表胚层的皮层中的微丝网发生收缩，使其表面卷曲变狭，这就对同它密切相连的被膜层产生一种拉力，同时也对内表胚层产生一种拉力，使被膜层和内表胚层一起下包。而内胚层表面有许多长的微绒毛，它们随外包的进展而逐渐变短，这就为外包时提供足够数量的膜；同时在这些微绒毛中也有大量的微丝，为外包也提供了收缩条件。此外，接近表胚层的被膜层细胞的皮层中也有许多微丝网，同时还以紧密连接和闭锁连接相连接，这也为外表胚层产生拉力是把被膜层一起向下包提供了结构上的条件。如果把外表胚层连接的被膜层边缘切去，胚盘立即缩回去，胚盘就不发生外包，而表胚层仍能独立完成其外包过程，并且外包的速度要比有胚盘存在的更快。 被膜层在外包时其细胞数量增加不多，所以外包不是依靠它的细胞数量的增加，而是依靠细胞形状发生改变和细胞的重新排列，细胞纵向伸长的结果。被膜层不参与胚胎的器官发生，只形成胚胎的外胚层表皮。 由于胚盘不断向植物极外包，最终在植物极处形成一胚孔，至此原肠作用才告结束。 §1.2 早期胚胎的形成 §1.2.1神经系统的形成 在被膜层下面的预定神经物质向中央集中形成一实心的，以后在此细胞索中央裂出缝状的腔，逐渐成为管状的神经管。在神经管前端膨大成脑部，并产生两个收缩，这样就把脑部分为前脑泡、中脑泡和后脑泡，其后为管状的脊髓。 硬骨鱼的前脑很不发达，因此不形成脑曲。首先在前脑两侧凸出一对视囊，这时前脑分为端脑和间脑。端脑向前伸出一对较长的嗅神经和嗅球。在端脑和间脑交界处的脑部顶壁甚薄，附以血管形成前