小鼠颈部异位心脏移植模型制作.doc

小鼠颈部异位心脏移植模型制作 目前多采用大鼠心脏移植模型，其缺点在于：1.大鼠的遗传背景资料没有小鼠完善；2.目前的转基因及基因敲除动物多为小鼠；3.针对小鼠的诊断试剂种类要比大鼠丰富得多。鉴于此，建立了小鼠的心脏移植模型是目前研究移植免疫最主要的模型。 一、 实验动物：供、受者均选用雄性近交系小鼠如Balb/c(H-2d)， 10～12周龄,体重25-30g。 二、 实验器材： 36倍手术显微镜(Wild M691)，10/0血管缝线（Ethicon公司或上海医用缝合针厂），一次性电凝器(John Weiss ＆ Son Ltd.公司)， 三、 麻醉剂：Hypnorm与Hypnovel（Janssen 公司）。麻醉剂Hypnorm与Hypnovel均用蒸馏水按1：4稀释，等体积混合后，小鼠腹腔注射0.15～0.2ml/只。 四、 供心切取术 小鼠四肢固定，剃毛,75﹪酒精消毒,正中开腹，暴露下腔静脉，注射20u/ml肝素生理盐水1ml,横断下腔静脉及主动脉放血,横断膈肌，从双侧锁骨中线由下至上直至锁骨剪开，离断前胸壁，0～4℃生理盐水停搏心脏，去除周围脂肪组织及胸腺，10倍手术显微镜视野下用6-0丝线近心房处分离结扎右上腔静脉并右心房及下腔静脉，远端剪断；游离升主动脉及主动脉弓，在无名动脉分支处远心端结扎主动脉，远端横断。在无名动脉分支处远心端横断。游离肺动脉主干并在分支处剪断，左上腔静脉、左心房与肺静脉用6-0丝线结扎，远端游离。全心修剪后保存于0～4℃生理盐水中。 五、受者手术 （一）移植部位的准备 小鼠四肢用纸胶布固定于手术板上，置一橡皮筋于上下切齿之间以固定头部，头朝术者，剃毛，消毒。自下颌中点至右锁骨中点处剪一长约１cm斜切口，游离皮下组织，灼断颌下腺体及部分脂肪组织，仔细游离右侧颈外静脉，在远心端分支处用丝线结扎，其间小分支用电凝器灼断，微血管夹近心端阻断静脉，并在远心端横断之；灼断右侧胸锁乳突肌，暴露颈动脉鞘，充分游离颈动脉，远心端结扎，微血管夹阻断近心端，横断颈动脉。 （二）供心植入术 用一小片吸水纸包裹供心置于受者右颈部，冰盐水降温，注意调整好供心位置以利吻合。在36倍手术视野下，供心无名动脉与受者颈总动脉作间用10－0 Ethicon血管缝线作端-端吻合，具体为先在3点（时钟定位法，下同）处吻合一针，然后在对侧９点处吻合第二针，前壁11点及１点处各吻合一针，顺时针翻转微血管夹及供心180°，暴露后壁，在后壁7点及5点处各吻合一针，然后还原至原来位置,共6针。注意尽可能使边距及针距均匀对称。接着用10－0国产血管缝线做供心肺动脉与受者颈外静脉连续端-端吻合，具体为先在3点处吻合一针打结，在原位由外向内向肺动脉内进一针，然后由右向左腔内连续缝合直至对侧9点处，再由左向右腔外连续缝合回3点处，不打结，留线头约0.5㎝，共缝约7～8针。吻合完毕后先开放静脉，若吻合口有渗血，可用小棉球轻压片刻即可，一般不需补针。随后开放动脉，若吻合口有出血，可间断开闭微血管夹，减轻吻合口压力，一般在3～5分钟内间断开放2～3次可以止血，如仍出血可考虑补针。开放后1－2分钟供心即可由纤颤变为复跳。观察5～10分钟后，调整移植心于合适位置以防血管扭曲。缝合皮肤。小鼠一般15～20分钟后可以自行翻身爬行，饮水进食。手术时间60±5min,平均冷缺血时间40±3min。 六、术后观察 视诊及触诊：术后易见颈部移植心搏动明显,节律整齐，每日上下午各触诊一次，觉搏动有力，节律整齐，约140～160次/min。若术后1天内触诊移植心明显变小，心搏无力或明显增大，质硬，心律变慢，则多有动脉血栓形成或动脉卡压及静脉吻合口狭窄等并发症，应视为手术失败。 七、小鼠心脏移植的优点及常见手术并发症和对策 小鼠以其完善的遗传背景资料，丰富的种类以及齐全的诊断试剂，在器官移植研究中已成为首选的实验动物，而小鼠心脏移植模型是理想的移植免疫研究模型之一，这一模型早在1973年就为Corry所建立，但由于对显微外科的设备和技术要求比较高，国内目前仅少数中心能利用该模型开展研究工作。 与传统的小鼠腹部心脏移植手术相比，小鼠颈部心脏移植手术的优越性在于： ⑴不需开腹，无需阻断大血管，对受者血液循环干扰小，整个手术出血仅0.05 ml左右，相对比较合理；而小鼠腹部心脏移植需阻断腹主动脉及下腔静脉等大血管，对受者体循环影响比较大，且极易发生下肢瘫痪等术后并发症 。 ⑵操作步骤相对简便，初期可能对血管吻合要求比较高，但一旦掌握后，手术迅速而简便。 ⑶易于观察及触诊供心搏动情况，无需心电图监测。 ⑷可在受者腹部接受再次移植（如心、肾移植等）。 ⑸由于手术不需开腹，仅在颈部作一小切口，在很大程度上降低了感染发生的机会，这一点对用裸鼠作为受者的实验显得尤为重要。 小鼠颈部心脏移植手术的常见并发症如下： ⑴动脉并发症：主要由于动脉微血栓形成与卡压，扭曲等原因所造成。 ①动脉血栓形成：为早期的常见并发症，主要原因为以下几点： Ⅰ.显微外科操作不熟练，造成吻合针数过多或狭窄，吻合后补针，而颈动脉本身只有0.5-1mm粗细，从而导致血栓形成。 Ⅱ 血管对合不佳，或有异物（如血块，毛发等），易致血栓。 Ⅲ 吻合时缝线误挂对壁，形成血栓。 Ⅳ.开放后漏血，小棉球轻压可止血。但可能形成较大血栓，造成动脉阻塞。 ②颈动脉鞘游离不充分，吻合口在游离的鞘膜边缘处形成一明显卡压，造成血供不佳。 ③扭曲：由于颈部空间相对狭小，若供心无名动脉或受者颈动脉保留过长，缝合皮肤后易致动脉扭曲，血供不佳。 ⑵静脉并发症：小鼠颈静脉极薄且透明，吻合质量的好坏直接关系到手术的成败。 ①静脉吻合口狭窄：是克服动脉难点后的最常见并发症，动脉开放后可见肺动脉迅速膨大，心脏发紫，极度狭窄时吻合口破裂。小鼠静脉的吻合与一般静脉吻合有一定的区别，主要在于不必缝得太“实”，而是利用缝线的弹性将两侧的血管撑起来，形成一个圆形的支架。因此静脉不必缝太多针，只需将两侧的血管“粘”在一起，相邻两针点间的管壁无缝隙即可。在缝合前一定要找准血管吻合口的最左端，后壁最后一针一定要将最左端的两点对合。开放后发现有狭窄时，可试用血管扩张的办法，具体左法为夹住吻合口3点及9点处的管壁左右牵拉，夹住吻合口12点及6点处的管壁上下牵拉。 ②静脉壁撕裂：多见于后壁，极薄，透明难辨，初学者极易撕裂。 ⑶其他：如供心心房出血，漏血，多为取心时不慎造成。 总之，小鼠颈部心脏移植是进行移植免疫及药理等研究的重要模型，虽然制作较为困难，但是经过多次练习（100次左右），应该可以掌握。