小鼠肝细胞线粒体的染色观察.docx

实验四. 小鼠肝脏细胞线粒体的染色观察 山东大学实验报告 2013 年4 月14 姓名 系年级 2011级生命基地 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 小鼠肝细胞线粒体的染色观察 学号 实验四.小鼠肝细胞线粒体的染色观察 Lab4. Staining and observation of mitochondria in mouse liver cells 摘要：线粒体是细胞的“动力工厂”，对生物体的能量代谢活动起着至关重要的作用，线粒体在代谢活动旺盛的细胞中大量存在，如肌肉细胞、肝细胞、神经细胞等。对此类细胞进行活体染色，对研究线粒体的性质、活动有着重要意义。此次我们采用小鼠的肝脏细胞，对其进行活体染色，在显微镜下观察线粒体。 关键词：线粒体、活体染色、小鼠肝脏细胞 前言：活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类，体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学“特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用；一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(JanusgreenB)和中性红(neutralred)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。 线粒体的直径一般为0.5-1.0μm，长1.5-3.0μm，在光学显微镜下可见。在动物细胞中，线粒体大小受细胞代谢水平限制。不同组织在不同条件下可能产生体积异常膨大的线粒体，称为“巨线粒体”（megamitochondria）：胰脏外分泌细胞中可长达10-20μm；神经元胞体中的线粒体尺寸差异很大，有的也可能长达10μm；人类成纤维细胞的线粒体则更长，可达40μm。有研究表明在低氧气分压的环境中，某些如烟草的植物的线粒体能可逆地变为巨线粒体，长度可达80μm，并形成网络。 线粒体一般呈短棒状或圆球状，但因生物种类和生理状态而异，还可呈环状、线状、哑铃状、分杈状、扁盘状或其它形状。成型蛋白（shape-forming protein）介导线粒体以不同方式与周围的细胞骨架接触或在线粒体的两层膜间形成不同的连接可能是线粒体在不同细胞中呈现出不同形态的原因。 不同生物的不同组织中线粒体数量的差异是巨大的。有许多细胞只拥有多达数千个的线粒体（如肝脏细胞中有1000-2000个线粒体），而一些细胞则只有一个线粒体（如酵母菌细胞的大型分支线粒体）。大多数哺乳动物的成熟红细胞不具有线粒体。一般来说，细胞中线粒体数量取决于该细胞的代谢水平，代谢活动越旺盛的细胞线粒体越多。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基部；在精子中分布在鞭毛中区。在卵母细胞体外培养中，随着细胞逐渐成熟，线粒体会由在细胞周边分布发展成均匀分布。线粒体在细胞质中能以微管为导轨、由马达蛋白提供动力向功能旺盛的区域迁移。 线粒体的化学组分主要包括水、蛋白质和脂质，此外还含有少量的辅酶等小分子及核酸。蛋白质占线粒体干重的65-70%。线粒体中的蛋白质既有可溶的也有不溶的。可溶的蛋白质主要是位于线粒体基质的酶和膜的外周蛋白；不溶的蛋白质构成膜的本体，其中一部分是镶嵌蛋白，也有一些是酶。线粒体中脂类主要分布在两层膜中，占干重的20-30%。在线粒体中的磷脂占总脂质的3/4以上。同种生物不同组织线粒体膜中磷脂的量相对稳定。含丰富的心磷脂和较少的胆固醇是线粒体在组成上与细胞其他膜结构的明显差别。 线粒体由外至内可划分为线粒体外膜（OMM）、线粒体膜间隙、线粒体内膜（IMM）和线粒体基质四个功能区。处于线粒体外侧的膜彼此平行，都是典型的单位膜。其中，线粒体外膜较光滑，起细胞器界膜的作用；线粒体内膜则向内皱褶形成线粒体嵴，负担更多的生化反应。这两层膜将线粒体分出两个区室，位于两层线粒体膜之间的是线粒体膜间隙，被线粒体内膜包裹的是线粒体基质。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，为细胞的活动提供了能量，所以有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。 肝脏具有强大的代偿功能和旺盛的再生能力。肝脏一旦受到损害，肝脏内蛋白质和核酸的合成就显著增加以促进其再生修复。肝脏代谢活动的增强必然消耗大量的ATP，如果机体产生ATP不足,肝脏的再生修复则难以进行。因此，肝脏损害时再生修复能力的大小，即肝脏代偿功能的强弱，首先取决于肝脏能量代谢的正常与否。细胞内ATP几乎均在线粒体内产生。因此，肝脏线粒体代偿功能的大小乃是能量代谢的本质。也因此肝脏细胞中含有丰富的线粒体。 下图为小鼠内部解剖图，可见小鼠肝脏的位置。 实验试剂及器材： ♦试剂： l ▶小鼠 l ▶Ringer缓冲液 l ▶詹纳斯绿 ♦仪器、工具： l ▶解剖盘 ▶剪子 ▶镊子 ▶光学显微镜， ▶载玻片，盖玻片 实验操作： ◆用断颈法处死小鼠。 ◆打开腹腔，在横膈膜下方，胃的前方找到深红色的肝脏。 ◆取出肝脏，在薄边缘处，剪取两块组织，长5mm，宽 2-3mm。 ◆在烧杯中用 Ringer缓冲液尽量洗去血液。 ◆将两片组织分别放在双凹片的凹陷处，加詹纳斯绿，一片完全浸没，一片只浸没一半。染色20-30 分钟，直至浸没一半的样品的边缘变成蓝绿色。 ◆将样品转到小烧杯中，用 Ringer缓冲液洗去染液。 ◆在1ml Ringer缓冲液中，用剪刀将样品剪碎，释放肝细胞。 ◆取上述肝细胞悬液，制作滴片，显微镜下观察。 实验结果： 实验照片： 实验结果描述： （1）在打开小鼠腹腔后，可找到呈淡红褐色的肝脏，其边缘很薄，呈小三角形状；在取下肝脏的操作中，发现其比较柔软，易被镊子的尖端挑破。所以剪的时候要注意，既要是所得的组织块体积较小，又不要让其破碎。 （2）在将肝细胞进行染色的过程中，0-10min时，染色液半浸和全浸的细胞边缘均未着色；在17min左右，半浸的肝细胞边缘的部分位置出现蓝绿色，而全浸的细胞边缘仍未着色；在25min左右，半浸肝细胞边缘全部变为蓝绿色，而全浸细胞边缘依旧未着色。 （3）由上面镜检图像可以观察到，在半浸染肝脏细胞的染色中，可以观察到内部出现绿色的圆形肝脏细胞，胞内绿色较浅，但是绿色的分布面积较大；该类富含线粒体的肝细胞在肝脏中分布比例比较高。而在全浸染肝脏细胞的染色中，可以看到，相对应的圆形细胞中，无绿色出现，看上去胞内为无色透明的胶质状态。 （4）在悬液中加入染液进行直接观察的一组镜检图像，在染液加入半浸肝脏细胞悬液中，可以看到内部染成较深地蓝绿色的圆形肝脏细胞，并且可以更清晰地观察到该类细胞在镜下分布广泛，含量较多，染色效果 较好；在染液加入全浸肝脏细胞悬液中，在镜下看到相对应的圆形细胞中有蓝绿色出现，但颜色较浅，胞内仍为无色透明状态。 （5）在镜检时可以发现，肝脏中细胞和物质的种类多样，除上述富含线粒体的独立存在的较大圆形细胞外，还分布有呈小颗粒状的圆形细胞、极少量呈条带状的杆状细胞以及聚集在一起，呈现蓝绿色的圆形细胞群等；并且在肝脏中还可以发现，边缘呈刺突状的不规则糖原物质。 分析与讨论： （1） 牺牲小鼠的时候，手法总结为“稳、准、狠”；首先是要抓稳小鼠的尾巴，必要时可以将小鼠的尾巴在手指上绕一圈；二是要找准脱臼的位置，在双耳和前肢之间，不能太靠前，小鼠会向后缩，太往后的化，脊椎不易断，不方便向下用力；用剪刀向下按的时候。要快速，不能犹豫，同时要快速将小鼠的尾巴向后拉，这样就可以快速的牺牲小鼠，也避免了小鼠处死时的痛苦。用剪刀时，要注意剪刀的拿捏方式，正确的拿捏方式可以使处死小鼠的过程更为方便。 （2） 打开小鼠腹腔的时候，开口在横膈膜下方，比上次实验的开口要往上一些，但要注意不能剪到胸腔处。 （3） 打开腹腔后，可以看到肝脏位于左手边，呈红色，但颜色有一些偏淡，不要与右手边血红色的脾脏混淆，切下小鼠的肝脏，备用，剪的时候要注意避开各种血管，防止出血量过多凝结。 （4） 从小鼠肝脏上取组织块的时候，要选取薄边的一端，从此处取2小块，这一部分血少，易取（另一端太厚，不易取也不易染色，而且剪的时候出血量比较多）。 （5） 剪下来的组织块要立即放到Ringer缓冲液中去洗去其上的血液，因为如果组织块长时间暴露在空气中的话，其上的血液会凝固，使得染色操作变得困难，洗的时候用镊子轻轻的夹住涮洗，这样可使血液快速的被洗脱，但不要太用力，这样会将组织块弄碎。 （6） 染色时染液从组织块边缘处滴加，使染液慢慢浸过组织块或浸到一半，不能从组织块上方滴加，这样半浸的一组上半部分也会接触到染液，影响实验效果。 （7） 由于染色不是很容易，所以可以适当的延长染色的时间，不要只局限于实验步骤中的30分钟。 （8） 将组织块剪碎时，要注意拿剪刀的方式，学会灵活运用各种工具；剪的时候要将其尽量剪碎，使小烧杯中的液体成悬浊液的状态。 （9） 镜检时要注意区分线粒体与糖原细胞的区别，同时还要判断线粒体染得是蓝色还是绿色，注意对比。而且制作装片时，所滴加的悬液不要过多，液体过多会导致细胞在显微镜下快速流动，给观察增加了不小的难度，很难找到合适的线粒体进行观察和拍照。 （10） 直接向悬液中滴加染液时，所加染液要适量，过多的话，显微镜下的线粒体会覆盖一层很淡的蓝色，影响观察。 （11） 肌细胞含线粒体同样丰富，希望可以也对其进行实验观察，与肝细胞线粒体进行对比。 参考文献： [1]韩贻仁 主编．2007．分子细胞生物学．第三版．北京：高等教育出版社 [2]王崇英、高清祥 主编．2011．细胞生物学实验．第三版．北京: 高等教育出版社 [3]王镜岩 朱圣庚 徐长法 主编.2002．生物化学．第三版（下册）．北京: 高等教育出版社 [4]百度百科