细胞培养-复苏-传代换液-冻存计数(自编).doc

细胞培养程序 材料 A、仪器 1. 净化工作台，2. 离心机，3. 恒温水浴箱，4. 冰箱（4℃）5. 倒置相差显微镜，6. CO2培养箱，7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器 B、玻璃器皿 1. 吸管，2. 小烧杯（100ml），3. 废液缸， C、塑料器皿 1. 吸头，2. 枪头，3. 96孔培养板，4. 15ml离心管，5. 50ml离心管，6. 胶塞， D、其他物品 1. 微量加样枪，2. 红血球计数板， F、试剂 1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，4. 双抗（青霉素、链霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025% EDTA 7. 二甲基亚砜（DMSO）， 8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。 一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养： （一）细胞原代培养 1.贴壁细胞培养法： 1）、组织块培养法 将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2遍，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。 或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。 培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 其他方法：消化分离法 、器官培养 略 2.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 （二）细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 二、细胞维持培养（细胞换液培养）、培养选拔常规观察 (一)原代细胞的维持 1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次，其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。 待不同组织块周围的细胞连接成片时即可传代。 2、悬浮细胞 凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。 半量换液的方法如下： 将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min 10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。 （二）传代细胞维持培养：同上 （三）培养选拔常规观察： 1.培养液 2.细胞生长情况 3.细胞形态变化 4.污染情况 三、细胞的传代培养： (1)弃旧培养液：吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。 (2)漂洗：每瓶加入2mL，无钙、镁PBS或HANKS液，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。（可以省略） (3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变园后加适量完全培养液终止。或细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化）。在37°或25°以上环境进行消化。 (4)终止：加入完全培养基适量（通常10-20%胎牛血清培养基）5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。 (5)离心：离心（1100rpm）沉淀细胞（5-10分钟），去除培养基（含胰酶及EDTA）。 (6)计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度。 (7)传代或冻存：离心后用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养（可1:3至1:5传代，在25cm2的培养瓶中长满细胞可达5*106/ml，经10倍稀释每瓶达105/ml即可，25cm2的培养瓶每瓶5ml培养液）。或用冻存液调整浓度（一般达1*107）冻存。（ 到此步时经证实未被细菌或真菌污染，则撤去抗生素，以免对细胞的生长长生不利影响，指原代培养细胞） 四．细胞冻存： 细胞冻存液：20% 小牛血清 10% 二甲基亚砜DMSO 70% 培养液 或，10% 二甲基亚砜DMSO 90% 小牛血清 操作步骤： 选对数增生期细胞（证明无支原体污染），在冻存前一天换液。 按常规方法把培养细胞制成悬液，计数，使细胞密度达5*107/ml左右，离心，去上清液。（冻存细胞数量要充分，密度达5*107/ml，在溶后稀释20倍时，仍能保持5*105ml数量）。一般25cm2的培养瓶满瓶才达到105. 加入配置好的冻存液，与去上清液相同的量一滴一滴的加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10%二甲亚砜(DMSO)或甘油，可使冰点降低，使细胞内水份在冻结前透出细胞外。（细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO和90-95%原来的细胞生长用之新鲜培养基均匀混合。注意由于DMSO稀释时会释放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成） 分装于无菌冻存管中，每管1.5ml悬液。 旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标志。 冻存： 冰箱4℃放2小时，-75℃过夜，转液氮保存， 4°，0°，-20°各30分钟（现代分子生物学实验技术P647），最后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。 附件一、培养细胞的生长状况观察 （一）细胞计数操作规程 胎盘蓝法原理：（产品批号：T8154，T6146和Z35,962－9） 使用胎盘蓝染色决定血细胞总数和活细胞数目，胎盘蓝是用于染色的多种染料中能被活细胞排斥的一种染料，这种方法的成立是基于活细胞不能被染色：胎盘蓝对血清蛋白比细胞蛋白有一种更强的亲和力，如果背景太深，在计数之前细胞应成球状并重悬在无蛋白的培养基或盐液中。 方法： 1、预先在平衡盐液中悬浮细胞（例如：Hank’s平稳盐液HBSS，产品批号：H2513） 2、取0.5ml　0.4%胎盘蓝于一试管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml细胞悬液（稀释倍数＝5）并且混匀，允许放置5－15分钟。 注意：如果细胞在胎盘蓝中暴露时间过长，活细胞也会像死细胞一样被染上色。 3、在血细胞计数板上盖上盖玻片，使用巴斯德毛细吸管或其它合适的器材取少量的胎盘蓝细胞悬液于血细胞计数板上的两个小室中。将巴斯德毛细吸管小心的靠在盖玻片边缘，利用毛细张力充满小室，不要过度或过少充盈。 1）从血细胞计数板的一个小室开始，计数中间和四角边长/mm的正方形中的所有细胞数（详见sigmaP1845的图样I）死细胞被染成蓝色，分别计数活细胞和死细胞数。 注意：压线细胞的计数原则，数上不数下，数左不数右（详见sigmaP1845的图II） 2）重复上述步骤计数第2个小室 注意：如果超过10%的细胞成串，应重复全部程序通过吹打务必使细胞在原液中和在胎盘蓝细胞悬液中一样分散，如果在10个正方形方格中细胞数少于200个或多于500个（20－50个细胞/正方形）应重复这个步骤，以调节细胞稀释倍数。 3）准备第二份样品并重新计数以保证准确 4）细胞计数－血细胞计数板上盖好盖玻片的每个正方形（指中央大方格，其长度宽度均为1mm的正方形，与盖玻片的距离为0.1mm），总体积为0.1mm3或10-4cm3。若1cm3近仍等于1ml，那么每毫升中集中的细胞数（和细胞总数）则可以这样来计算。 每毫升细胞数＝每个正方形的平均细胞数´稀释倍数´104（10个正方形的细胞计数） 例：如果每个正方形的平均细胞数是45´5´104＝2.25´106个细胞/ml 总细胞数＝每毫升细胞数´最初的细胞样品的体积 例：2.25´106 (个细胞/ml) ´10ml（最初体积）＝2.25´107个细胞（总细胞） 5）活细胞比例（%）＝总的活细胞数（没染上色的）¸总的细胞（染上色的和没染上色的）´100 例：如果每个正方形中没染上色的（活的）细胞平均数是37.5，总活细胞数＝(37.5´5´104)活细胞数/ml´10ml（最初体积）＝1.875´107个活细胞，活细胞比率（%）＝1.875´107（活细胞数）¸2.25´107(总细胞数) ´100＝83%. 血球计数板的使用 16×25型的计数板 将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算： 酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100 ×400×10000×稀释倍数或：4个中格的细胞数/4×16×10000×稀释倍数 有一种计数板的结构为25×16，计算如下：4个中格的细胞数/4×25×10000×稀释倍数 （二）.细胞生长曲线（细胞贴壁率、细胞分裂率：略） 概念：细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数