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血清成分分析 作者：冯晓帆 （温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 ，325000） 摘要：本次实验通过邻苯二甲醛法对血清中的胆固醇进行了定量测定；通过盐析、透析与浓缩首先把血清蛋白分成血清清蛋白与γ-球蛋白，再通过醋酸纤维薄膜电泳发对其进行了鉴定，发现血清中含有清蛋白、α1、α2、β、γ五种蛋白；我们还对血清成分之一的谷丙转氨酶分别对其活性和活力进行了鉴定与测定，让我们对血清的成分有比较深的了解。 关键词：血清、谷丙转氨酶、胆固醇、蛋白 The blood serum ingredient analyzes the author: Feng Xiaofan (Wenzhou University life and environmental science institute, Zhejiang Wenzhou, 325000) abstract: This experiment has carried on the quantitative determination through the neighbouring phenyl dimethanal law to blood serum's cholesterol; Through the salting out, the dialysis and the concentration first divide into the serum albumin the blood serum albumen with Gamma - the globulin, sent again through the acetate film electrophoresis to it has carried on the appraisal, discovered that in the blood serum included the albumen, α1, α2, Beta, Gamma five kind of proteins; We also to of Gu blood serum ingredients Bing the transaminase separately has carried on the appraisal and the determination to its activeness and the vigor, lets us have the quite deep understanding to blood serum's ingredient. key word: Blood serum, valley third transaminase, cholesterol, protein 前言： 血液是凝固析出的淡黄色透明液体。血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。它能提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。它也能提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等，能提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁（结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用）；它还能提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤与对培养中的细胞起到某些保护作用等等。总而言之，血清在多方面都起着各种各样的作用，因此对血清成分的了解与分析就显得尤为重要，是实在必要的。 实验材料： 　⑴、供试材料 ① 、兔子免疫的血清、兔子未免疫的血清、肝脏 ②、邻苯二甲醛试剂：称取邻苯二甲醛（A.R.）50mg，以无水乙醇（A.R.）溶解并稀释到50mL，冷藏，有效期1个半月。 ③ 、标准胆固醇应用液（0.1mg/mL）：准确称取胆固醇（A.R.）100mg以醋酸定容至1000mL。 ④ 、PBS 、(NH4)2SO4溶液 、双缩脲试剂 、酪蛋白 、蔗糖 、BaCl2溶液 ⑤ 、1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和） 1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和） 0.1%标准谷氨酸溶液 0.1%标准丙氨酸溶液 ⑥ 、酚的饱和水溶液 将2份酚和2份水（按重量计算）混合后，放入分液漏斗中，振荡。静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。 ⑦ 、0.1%KHCO3溶液 0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和） 2%乙酸溶液 0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液 1%KOH溶液 9%NaCl溶液 海砂 0.4mol/LNaOH溶液 ⑧ 、1/15 mol/LpH=7.4的磷酸缓冲液 取1/15 mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO4·12H2O23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L磷酸二氢钾（称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。 ⑨、 1、1mmol/L2，4-二硝基苯肼 称取2，4-二硝基苯肼20mg，溶解于10mL浓盐酸中，以蒸馏水定容至100mL。 2、2μmol/mL丙酮酸钠标准液 精确称取丙酮酸钠22mg，加磷酸缓冲液溶解后，定容至100mL。临用前配制。 3、GPT基质液 称α-酮戊二酸，29.2mg（2 mmol/L）及α-L-丙氨酸1.78g（200mmol/L）溶于50mL，pH=7.4的磷酸缓冲液中，加0.1mol/L NaOH溶液0.5mL，调pH为7.4，然后加磷酸缓冲液定溶至100mL，加少许氯仿防腐，置冰箱中可保存一周。 ⑴ 实验仪器 ①、 离心机 ②、 透析袋 ③、 微量进样器 ④、 可见光分光光度计 ⑤、 凝胶柱 ⑥、 铁架台 ⑦、 水浴锅 ⑧、 电子分析天平 ⑨、 玻璃棒 ⑩、 试管、吸管、量筒、研钵、三角烧瓶、烧杯、锥形瓶、剪刀及滤纸 实验方法： ⑴ 邻苯二甲醛法 1、标准曲线的绘制 取清洁干燥试管5支，编号，按表2加入试剂。 表2 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线的绘制 编号 试剂 编号 编号 编号 编号 编号 0 1 2 3 4 标准胆固醇应用液/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 醋酸/mL 0.4 0.3 0.2 0.1 0 邻苯二甲醛试剂/mL 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 蒸馏水/mL 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 混合酸/mL 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 100mL血清中总胆固醇含量/mg 0 100 200 300 400 A550nm 加毕，混匀，静置10min，以550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。 2、样品的测定 取2支清洁干燥试管，编号后，按表3加入试剂。 试管 试剂 表3 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——样品的测定 对照 样品 醋酸/mL 0.4 0.4 血清/mL 0.01 0.01 邻苯二甲醛试剂/mL 0 0.2 无水乙醇/mL 0.2 0 混合酸/mL* 4.0 4.0 加毕，混匀，静置10min，于550nm波长比色，以对照管校零点，对照标准曲线即知100mL样品中总胆固醇含量（mg）。 ⑵、盐析法 血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析实验步骤 取离心管一支，加入2mL血清 加入2mLPBS（稀释血清），摇匀 逐滴加入pH=7.2的(NH4)2SO4溶液2mL，边加边摇 静止30min，离心20min（v=3000rpm） 上清液（主要含有清蛋白） 沉  淀（主要含有γ-球蛋白） 加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液饱和 加1mLPBS溶解 静止30min 逐滴加入饱和(NH4)2SO4溶液0.5mL (相当于33%饱和 (NH4)2SO4溶液) 离心、沉淀 加1mLPBS溶解沉淀 放置30min 放入透析袋 离心20min（v=3000rpm）* *放弃离心后的上清液（主要是α、β球蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白 ⑶、透析与浓缩法 1. 取玻璃纸（15cm×15cm）两张，折成袋状。将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和γ-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。 2. 用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，将烧杯放在微量振荡器上振荡1h（中间换水1-2次）。 3. 将透析袋取下，小心将线绳解开，用滴管吸收袋内的液体放入干净的试管中。 4. 用双缩脲法分别检查袋内外液体蛋白质。在用BaCl溶液检查烧液体的NH4+和SO42-。记录实验现象，观察透析法除盐的结果。 5. 将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩。 ⑷、凝胶层析法 凝胶层析的实验步骤 过程名称 实验步骤 凝胶预处理 4g葡萄糖胶G-25放入100mL烧杯中 50mL蒸馏水 小火煮沸1h 静止、冷却、倾弃蒸馏水 加入PBS10mL 轻轻搅拌至凝胶悬起 倾入10cm×1.0cm层析柱（用玻璃棉堵住下口，下口套一橡皮管） 装柱     将全部凝胶都倾入柱内，且液面接近凝胶面时，用螺旋夹将橡胶管夹紧，在将柱内凝胶面上平铺一张小圆滤纸片，然后小心放松螺旋夹，使液体缓慢流出，到液体刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。 加样     用胶头吸管将滤纸上方清液吸出，加入重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口，安装生理盐水加入装置。 洗脱     用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使液体的流速达到6-7dpm。 收集 混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。 ⑸、醋酸纤维素薄膜电泳法 醋酸纤维素薄膜电泳实验步骤 浸泡     将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。 点样     用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。 电泳     将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。 染色     将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重，染色10min。 漂洗     将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。 ⑹、纸层析法 纸层析方法 取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆 通过中心将滤纸绘成四等分扇形，用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm） 在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm 取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面 将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触 用大小相同的培养皿盖在滤纸上 溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h） 80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色 实验结果： ⑴、 血清中胆固醇的测定 胆固醇含量 吸光度 对照 样品 不免疫血清 -0.001 -0.086 免疫血清 -0.001 -0.048 ⑵、洗脱曲线 波峰低一点的蓝色曲线为蓝聚糖，波峰高一点的黄色曲线为重铬酸钾。我们总共收集27小试管，1到5，12、27好试管都为无色，6到11试管为蓝色液体，13到26试管为黄色液体。 ⑵ 、纤维素薄膜电泳的实验结果