胃溃疡模型.doc

胃溃疡实验模型探索 1 病因病机 消化性溃疡是一种常见的消化系统慢性病。中医学属“胃脘痛”范畴。胃脘痛又称胃痛，临床表现以胃脘部经常疼痛为主症，痛时连及胁背，或兼见恶心、呕吐、吞酸、嘈杂，大便溏薄或秘结，甚至吐血、便血等症【1】。 胃、十二指肠溃疡的病因和发病机理较为复杂，迄今尚未完全阐明。目前认为胃、十二指肠是一种多病因疾病，各种与发病有关的因素如胃酸、胃蛋白酶、感染、遗传、环境、饮食、生活习惯、神经精神因素等均可诱发溃疡产生。而胃酸-胃蛋白酶的侵袭作用增强和胃粘膜防护机制的削弱是本病发生的基本原理，任何影响这两者平衡关系的因素，都可能是本病发病及复发的原因。其次幽门螺杆菌的感染可引发胃内多种炎性介质的释放，这些炎性介质可致胃黏膜的损伤。 胃、十二指肠溃疡在中医学属于胃痛、胃脘痛、心痛等范畴。中医认为该病的发生主要由于情志失调，伤肝犯胃；饮食不节或劳倦过度，脾胃虚寒；外感寒邪，内客于胃等导致胃失和降、气机不利、胃失濡养而发生胃脘痛。胃脘痛的发生，其病变脏腑主要在胃，但与肝脾关系密切，胆肾也与之相关。若久病人络，瘀血阻滞胃络，络脉损伤，则会出现吐血、便血等症。 ２　溃疡模型的种类与方法 幽门结扎型溃疡、应激性溃疡（水浸法）、胃粘膜损伤性溃疡（醋酸法）、药物诱发型溃疡。四种溃疡动物模型总的特点是：结扎法溃疡为圆形、椭圆形、线性，结扎后随时间延长，溃疡数目增加，溃疡恒定发生在前胃部，深达肌层。应激法溃疡数量多，水温超过24℃溃疡出现少而轻，水浸8h以上开始出现溃疡，随时间延长溃疡数量增加，溃疡均发生在腺胃部，溃疡浅表，均不累及粘膜肌层。醋酸法溃疡发生在注射部位，溃疡部位胃壁增厚，溃疡数与注射醋酸部位准确与否有关，病理组织学改变与人类慢性溃疡近似。药物诱发性溃疡发生在腺胃部，溃疡数量少，体积小而浅表，仅累积粘膜上皮表层，部分深达粘膜腺体，但不超过粘膜肌层。 2.1　应激性溃疡模型 2.1.1 应激性溃疡原理 应激性溃疡发生机制有复杂的神经一体液因素参与，应激性胃溃疡是先使皮层中枢的兴奋和抑制过程失调，进而引起植物神经调节功能紊乱，导致迷走神经张力过高，致使胃肌强力收缩，压迫肌肉血管，引起继发性黏膜血管运动障碍，导致溃疡形成。人类由于严重创伤、烧伤等可产生急性应激性溃疡，精神过度紧张，强烈的情绪激动导致溃疡的发生或复发。与中医肝郁型自主神经系统功能紊乱有一定的联系。 2.1.2 应激性溃疡方法 选取体重在160~180g健康大鼠，禁食自由饮水48h后，将大鼠头向上束缚于老鼠固定器，以不能自由活动为度。随即将动物头部向上垂直浸泡在温度相对恒定(水温一般20℃左右)的冷水中，水平面在大鼠剑突部位，20h后取出，用颈椎脱位法处死动物，剖腹将胃取出，结扎贲门、幽门，从腺胃部注入1％ 甲醛10mL于胃中，并将全胃放入1％ 甲醛溶液浸泡10 min，沿胃大弯将胃剪开，用自来水轻轻冲洗胃黏膜面，用棉签拭去腺胃部血丝，然后展开腺胃部，肉眼或放大镜观察腺胃部黏膜损伤程度。溃疡位于腺胃部，表现为点状出血，并出现线状或直径为l-2mm圆形表浅性溃疡，溃疡的程度以溃疡指数表示，并计算溃疡的发生率。溃疡发生率：溃疡发生的动物数占试验动物数的百分比。 2.1.3　应激溃疡模型评价指标（以下指标对胃溃疡模型均适用） 图像积分法量化溃疡面积【5-6】：造模成功取胃后，沿胃大弯剪开，将胃壁展平，用数码相机将胃壁拍下，拍摄距离为10 cm．用 photoshop6．0软件处理图片，分辨率为72像素／英寸，每张图片设置为20 cm×15 cm(实物等比图片为4 cm×3 cm)，RGB格式，加网格线(视图显示网格)，然后对溃疡所占的格数进行积分。占一格者或大于等于1／2格记为1分，小于1／2格者记为0．5分，总计后作为积分．同样对胃总面积进行积分，将溃疡面积的积分与胃总面积的积分的比值代表溃疡面积比。全胃的溃疡面积比为该鼠的溃疡指数,根据溃疡指数进一步计算溃疡抑制百分率：溃疡抑制率百分率=(对照组溃疡指数-给药组溃疡指数)/对照组溃疡指数×100%。 图像积分法是统计溃疡面积／胃总面积的比值，可以消除胃面积大小不均造成的误差，使统计结果更精确，量化 并且，这种方法简单方便， 图像积分法是利用大众性的photoshop软件处理图像，实验室能达到此方法所需的条件及技术要求。 胃黏膜NOS测定【8-9】：内源性一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种重要的气体信使分子，在胃肠道各种生理及病理活动过程中起重要作用。NO血管内皮舒张因子能改善胃黏膜的微循环血流量，维持和加强胃黏膜屏障，抑制胃肠运动及调节胃酸分泌，从而有效地保护胃黏膜。NOS是NO合成过程中的关键酶，在应激状态下，大鼠胃黏膜氧自由基不断蓄积，并发生微循环障碍导致胃黏膜损伤，而NO的产生即可减轻胃黏膜的损伤以阻碍胃溃疡的发生与发展。抗溃疡药物对胃黏膜NOS的产生皆具有一定的调节作用，使其增加并维持在一个较高的水平，起到保护胃黏膜的效果，因此NOS的测定在抗溃疡药物研究中有一定指导意义。 按南京建成生物工程研究所提供的说明书进行操作。即：取大鼠胃黏膜组织0．1 g加9倍的生理盐水0．9 mL制备成10％的组织匀浆，3000 r／min，离心10 min，取上清50 μL测NOS活力，另取50 μL测蛋白含量。将测量值代人下述公式得出总NOS活力值。 总NOS活力=×＋蛋白含量 　脾指数的测定【8】：麻醉处死后取脾称重， 脾指数(％)=脾脏质量／体质量X 100％ 。 2.1.4 　注意事项 （1）动物体重大小应基本一致，笼底不能积留粪便，一面动物自食。 （2）溃疡程度与应激强度密切相关，包括应激时间、水温、水浸部位的高度因素，应严格控制，以免影响实验结果。 （3）注意应激时捆绑动物的松紧度，避免动物溺水死亡或来回移动影响水浸部位高度。 （4）雌性大鼠性烈，较易形成溃疡，实验时注意选用雌鼠。 （5）实验过程中动物需单笼饲养。 2.1.5 预实验结论 在应激实验摸索中，结合实验室条件，做应激胃溃疡模型应选用雌性体重160~180g健康大鼠为宜，应激过程中控制水温在23±0.5℃，大鼠浸泡20h后取出，在该条件下做应急胃溃疡实验，较易成功造模，重复性好，且模型肉眼可见溃疡较明显。 2.2 幽门结扎型溃疡 2.2 .1 幽门结扎型溃疡原理 结扎大鼠幽门造成胃液在胃中滞留，致溃疡因素增强，胃壁防御能力减弱，导致溃疡形成。 2.2 .2 幽门结扎型溃疡方法 选取体重在180~200g健康大鼠，禁食自由饮水72h后，用水合氯醛麻醉,打开腹腔,用缝合线结扎幽门十二指肠结合部。结扎时小心避开血管，缝合腹壁。术后18 h结扎贲门取出全胃，将胃浸入1%甲醛溶液中, 10 min后,在胃大弯处剪一小口收集胃液。然后沿胃大弯将胃剪开，用自来水轻轻冲洗胃黏膜面，将胃平铺于白纸上，观察溃疡发生情况。 2.2.3 幽门结扎型溃疡评价 　 pH值的测定:把取出的胃体沿胃大弯剪一小口,将胃液倾倒于刻度离心管中,用精密pH试纸测胃液的pH值,记录。 　 胃液量的测定:将上述胃液以3000r/min的速度离心10min后,用10ml注射器抽取离心管中的上清液,记录胃液总量,将胃液注入试管中。 胃酸的测定：将清晰胃液各取1ml分别置于小烧杯中，加入酚红指示剂2滴，用滴定管用0.01mol/LNaOH滴定直至溶液变红不退为止，即为胃酸的总酸度（mmol/L）。 胃蛋白酶的测定：采用麦特氏毛细玻管测定法。将内径1~2mm粗细均匀的毛细玻管裁成10cm长，洗净烤干待用。用鸡蛋一个，取其蛋清充分打匀后用滤布过滤，将备用毛细玻管利用虹吸作用，灌满蛋清（注意管内无气泡）。然后放在85℃热水中使蛋白凝固，贮冰箱中备用。试验时取胃液1ml放入50ml的三角烧瓶中，加0.05mol/L盐酸溶液15ml摇匀，放进蛋白管二根。塞好瓶口，在37℃恒温孵育24h，取出蛋白管，用尺测量蛋白管两端透明部分的长度(mm),以四端之值求其平均值。胃蛋白酶活性单位=平均值2×16；胃蛋白酶排出量（活性单位/h）=胃蛋白酶活性单位×每小时胃液量。 2.2.4 注意事项 （1）动物要严格禁食72h,以使胃内完全排空，否则食物残渣会影响胃分泌。 （2）手术幽门结扎时，须小心避开血管，否则因胃肠血液循环受阻而影响胃分泌。勿用器械钳夹胃壁，因器械对胃的刺激处，易形成溃疡，干扰试验。 （3）实验过程中动物需单笼饲养。 参考文献： [1] 王国庆，浅谈胃脘痛的辩证与治疗[J].中医研究，2009,22（6）：53-54. [2] 刘良，王建华，邵庭荫等，大鼠束缚水浸应激性胃溃疡模型的实验控制[J].中国药理学通报,1988,4(4):246-248. [3] 邢建峰，董亚琳，王秉文等，沙棘果肉油对大鼠胃液分泌的影响及抗胃溃疡作用[J].中国药房，2003,14(8):461-463. [4] 符健，韩丽，邢桂兰，姚茂忠等，秋茄提取物抗大鼠实验性胃溃疡作用研究[J]. 中国药理学通报，2007 ， 23(10)：1379—1383. [5] 王晓洁，杨立红，梁建光，小鼠实验性胃溃疡病理变化评定标准的量化[J]. 世界华人消化杂志，2005,13（14）:1709-1712. [6] 王晓洁杨立红梁建光，称重法计算胃溃疡面积的研究[J]. 中华消化杂志2004，24（3）：171-172. [7] 李仪奎，金若敏.中药药理实验方法学[M]．上海：上海科学技术出版社，2006:494-495． [8] 曹 鑫 ，张 宇 ，彭 岩等，紫锥菊多酚植物化学物质对大鼠应激性胃溃疡的影响[J].大连医科大学学报，2009,31（4）：283-286. [9] 聂时南,李兆申,许国铭等，急性实验性应激状态下大鼠胃粘膜NOS变化及与胃粘膜损伤的关系[J].中国临床心理学杂志，2000,8（4）:221-224.　 [10] 张小娜，张琳，郭春梅等，珍珠胃安丸药效学研究[J]. 中国药师，2008，11（9）：1037-1040. [11] 胡伏莲，消化性溃疡发病机理和治疗新理念[J].医学与哲学，2010,31（5）：13-15. [12] 刘波，香砂六君子汤抗实验性脾虚胃溃疡的药效学及其机理研究.