浅谈人免疫球蛋白M(IgM)的研制.doc

浅谈人免疫球蛋白M（IgM）的研制 杨向有1 李月2 （1上海新兴医药股份有限公司 上海 200135; 2山西康宝生物制品股份有限公司 山西 长治 046011) 【摘要】目的：从人血浆中分离IgM； 方法：采用低温乙醇法从人血浆中分离出组份Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀（含有大多数种类的人免疫球蛋白）；通过改变条件先把人免疫球蛋白中含量最多的IgG分离出去，而后上柱层析分离出分子量最大人免疫球蛋白IgM；配制除菌后制成冻干制剂。采用S/D灭活法和干热灭活法对产品进行病毒灭活。结果：制成纯度大于95％的IgM冻干制剂 结论：此方法可以很好的从人血浆中提取出IgM，制备人免疫球蛋白M（IgM）能更充分的利用血浆中的有效成分，具有很好的药用价值和广阔的市场前景。 Abstract Objective:Separate IgM from human plasma;Methods:It was isolated from human plasma component precipitationⅠ Ⅱ Ⅲ by low temperature ethanol(With most types of human immunoglobulin) First one by changing the conditions of the most abundant immunoglobulin IgG separated, Then isolated by chromatography on the molecular weight of the largest human immunoglobulin IgM, Made lyophilized after the preparation and sterilization. Use of S / D inactivation and dry heat-inactivated virus inactivation method products;Results: Made more than 95% of the IgM purity of lyophilized Conclusion: This method can well be extracted from human plasma IgM, preparation of human immunoglobulin M (IgM) to the full utilization of the active ingredient in plasma, with good medicinal value and broad market prospects. 【关键词】人免疫球蛋白M（IgM），低温乙醇法，层析，病毒灭活 Key words: Human Immunoglobulin, Low temperature ethanol method, chromatography, inactivation of virus 1. 人免疫球蛋白M（IgM）的简介 1.1人免疫球蛋白M（IgM） 免疫球蛋白由重链和轻链组成，根据重链(Heavy chain，H链)恒定区化学结构的不同，相应的免疫球蛋白被划分为多种类型，分别为免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)$1免疫球蛋白G(IgG)。[1-2] 人免疫球蛋白M (IgM) 存在于人的血清中，占血清免疫球蛋白总量的5~10%，血清浓度约1mg/ml，[3-4]主要由脾脏中浆细胞合成，一个IgM分子由5个单体通过J链连接成五聚体，有较高抗原结合价，也是五类免疫球蛋白（IgA、IgD、 IgE 、IgG、 IgM）中分子量最大的，其分子量为950k道尔顿，故又称为巨球蛋白。IgM 对防止菌血症起主要作用。[4] 1.2人免疫球蛋白M（IgM）与其他人免疫球蛋白各种性质的比较 表1：人免疫球蛋白M（IgM）与其他人免疫球蛋白各种性质的比较[2] Table 1: The human immunoglobulin M (IgM) and other human immunoglobulin Comparison of various properties 性质 IgM IgD IgG IgA IgE 分子量（kDa） 950 184 150 160 190 重链 μ δ γ α ε 亚类数 2 无 4 2 无 C区结构域数 4 3 3 3 4 辅助成分 J 无 无 J,SP 无 主要存在形式 五聚体 单体 单体 单体/二聚体 单体 开始合成时间 胚胎后期 任何时间 生后3个月 生后4~6个月 较晚 血清中Ig百分含量 5%~10% 0.3% 75%~85% 10%~15% 0.02% 血清中含量（mg/ml） 0.7~1.7 0.03 9.5~12.5 1.5~2.6 0.0003 半衰期（天） 10 3 23 6 2.5 抗体效价 5~10 2 2 2，4 2 其他作用 初次应答早期防御溶菌、溶血、血型抗体、BCR BCR 二次应答抗感染、抗菌、抗毒素、抗病毒 黏膜免疫局部抗菌、抗病毒 过敏反应抗寄生虫 1.3人免疫球蛋白M（IgM）的现状及应用 IgM抗体是迄今为止最大的实际发行量抗体。人免疫球蛋白M（IgM）制剂在临床上主要用于抗细菌感染,尤其是革兰氏阴性菌引起的脓毒血症的预防和治疗。主要通过提高体内针对各种细菌抗原的抗体效价、中和内毒素提高机体对内毒素的中和能力以及调节免疫系统发挥作用。[5] 2.人免疫球蛋白M（IgM）的免疫原理 单体IgM以膜结合型（mIgM）表达于B细胞表面，是B细胞抗原受体 (BCR)的主要构成成分；分泌型IgM为五聚体，五聚体IgM含10个 Fab段(抗原结合片段)，有很强的抗原结合能力；含5个Fc段(丙种球蛋白f成份)，比IgG更易激活补体。天然血型抗体为IgM，血型不符的输血可发生严重的溶血反应。[2] IgM的单体间以二硫键连接,并有一J链。IgM在抗体介导的体液免疫反应中比IgG所起作用更强,具体表现在极强的抗原中和作用、免疫调理作用,尤其其杀菌、溶菌、促吞噬及凝集作用比IgG高500~1000倍。[6] 3.人免疫球蛋白M（IgM）的研制方法 3.1人免疫球蛋白M（IgM）的研制流程图：见图1 3.2分离制作依据 ①采用低温乙醇法从人血浆中分离出人免疫球蛋白； ②依据表1中比较，IgM是分子量最大的免疫球蛋白，通过层析提纯，获得较高纯度的IgM制品。 ③病毒灭活：S/D灭活采用有机溶剂和表面活性剂进行协同处理,用于灭活血浆制品中的脂包膜病毒而不影响蛋白质的性质；[7] 对冻干后的制品进行干热灭活以达到进一步灭活脂包膜和非脂包膜病毒的目的。[8] 3.3操作步骤： ①领取冰冻血浆，在37℃以下合并融化； ② 将血浆温度降至0℃，在搅拌的条件下，加-20℃95%的乙醇，使乙醇最终浓度为20%，温度保持在-4.5~-5.0℃，产生的沉淀（组份Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）含有大多数种类的免疫球蛋白； ③沉淀（组份Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）用10倍的冰水溶解，在搅拌条件下，加-20℃95%的乙图1人免疫球蛋白M（IgM）的研制方法流程图 Figure 1 immunoglobulin M (IgM) flow chart of the development method 组份Ⅲ沉淀 冰冻血浆 领取 合并融化 组份Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀 100k超滤浓缩 10倍注射用水溶解 0.45μm滤芯过滤 S/D灭活 DEAE-Sephadex G-200吸附 超滤浓缩 配制 除菌过滤 组份Ⅰ上清 组份Ⅲ上清 用于分离IgG 组份Ⅰ沉淀 分装冻干 干热灭活 醇，使乙醇最终浓度为8%，温度保持在-1~-2℃，产生沉淀（组份Ⅰ）； ④分离出组份Ⅰ上清液，在搅拌条件下，加入-20℃95%的乙醇，使乙醇浓度到达15%，温度保持在-2~-3℃，分离出沉淀（组份Ⅲ）； ⑤将沉淀（组份Ⅲ）悬浮在10倍冰水中，用0.45μm滤芯过滤，滤液用S/D法灭活； ⑥灭活后，100k超滤浓缩； ⑦选用DEAE-Sephadex G-200层析柱，上柱层析吸附杂蛋白，在第一峰收集，所得即为较高纯度的IgM； ⑧将收集液超滤脱醇浓缩，确定计量制品体积，将浓缩液配制，以符合规定的理化指标，然后除菌过滤，分装，半压塞，入柜冻干； ⑨冻干结束后，真空压塞，制品出柜压盖，然后将制品置于沸水浴中30分钟进行干热灭活； ⑩对干热灭活后的制品进行检验，合格品于2~8℃储存。 4．鉴别 DEAE-Sephadex G-200层析柱用洗脱液（0.01Mol/L pH7.4PBS磷酸盐缓冲液（0.14Mol/L NaCl）洗脱， 紫外280nm进行监测，收集蛋白峰，第一峰即为IgM，分管收集。将第一峰的数管混合，进行含量、纯度和活性测定，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法鉴定IgM纯度。纯度应大于95％，> 95%浓缩。用酶联免疫分析法定量测定液体中IgM含量，免疫球蛋白M的标准是按1毫克/毫升。其余指标参照《中国药典》免疫球蛋白标准。 4.总结 本方法采用低温乙醇法从人血浆中分离出组份Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀（含有大多数种类的人免疫球蛋白），然后通过改变条件先把人免疫球蛋白中含量最多的IgG分离出去，而后上柱层析分离出分子量最大人免疫球蛋白IgM，配制除菌后制成冻干制剂。采用S/D灭活法和干热灭活法对产品进行病毒灭活。灭活剂（磷酸三丁酯、Tween-80）通过超滤浓缩等工序处理，完全达到规定对人安全的灭活剂残留量限值。 人免疫球蛋白M（IgM）是高效能的抗微生物抗体，[6]制备人免疫球蛋白M（IgM）能更充分的利用血浆中的有效成分，具有很好的药用价值和广阔的市场前景。 参考文献： [1]丁炜东，曹丽萍，曹哲明. 草鱼血清IgM蛋白的纯化及抗血清的制备.水生生物学报，2010年1月第34卷第1期164~169 [2] 刘生杰，余为一. 免疫球蛋白IgG和IgM分离纯化技术现状与展望. 阜阳师范学院学报，2006 年9 月第23 卷第3 期27~31 [3]金伯泉.医学免疫学.人民卫生出版社， 2008年7月第五版，44 [4]沈关心.微生物学与免疫学.人民卫生出版社，2008年4月第六版，25~26 [5]王焰，苗松.富含IgM的免疫球蛋白制剂研究进展.中国输血杂志，2005年12月第18卷第6期517~518 [6]毕爱华，王立人等.医学免疫学.人民军医出版社，1995,37~38 [7] 牟蕾，袁进，何勤. S/D法用于人凝血因子Ⅷ病毒灭活效果验证.中国输血杂志，2001年8月第14卷第4期222~223 [8] 马小伟，潘若文，范蓓等. 干热灭活病毒方法在冻干血液制品中的应用初探. 第七次全国生物制品学术会议论文汇编. 中国微生物学会， 20031001，200~203