细胞培养完整手册.docx

细胞培养完整手册 常用设备 准备室的设备： 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、 PH 计（测量培养用液 PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。 培养室的设备： 液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（ -80℃ ）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。 必须放在无菌间的设备： 离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、 CO2 孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、 4℃ 冰箱（放置 serum 和培养用液）。 无菌操作基本技术 无菌室的灭菌： 1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用 3‰ 来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5 ％过氧乙酸擦拭。 2.CO2 孵箱（培养箱）灭菌：先用 3‰ 新洁尔灭擦拭，然后用 75 ％酒精擦拭或者 0.5 ％过氧乙酸，再用紫外灯照射。 3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟 。 4.实验后灭菌：用 75 ％酒精（ 3‰ 新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 5.定期检测下列项目：钢瓶之CO2 压力；CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验人员的无菌准备： 1.肥皂洗手。 2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋 3.用75 ％酒精棉球擦净双手。 无菌操作的演示： 1.凡是带入超净工作台内的酒精、 PBS 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 ％酒精擦拭瓶子的外表面 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。 5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消： 一、新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。 2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5 ％稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。 3.刷洗、烘干： 12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g ：浓硫酸 200ml ：蒸馏水 1000ml ）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。 5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。 6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向 15 磅 时，维持 20-30 分钟。 7.高压消毒后烘干 二、旧的玻璃器皿的洗消： 1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。 2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液）， 12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗 3 次。 3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。 4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向 15 磅 时，调节电开关维持 20-30 分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上） 5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75 ％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅 高压（ 30 分钟）消毒，再烘干备用。 橡胶和塑料： 橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序： 1.针式滤器帽不能泡酸液 , 用 NaOH 泡 6-12 小时 , 或者煮沸 20 分钟 , 在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上 ( 凹向上 ) ，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内 15 磅 30 分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 2.胶塞烘干后用 2 ％氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟（用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 3.胶帽，离心管帽烘干后只能在 2 ％氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 4.胶头可用 75 ％酒精浸泡 5 分钟，然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶，培养板，冻存管. 6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70 ％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用 2—3 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000—100000rad 的 r 射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻 (CoC12·6H2o) 2g ，30％盐酸 10m 1，蒸馏水 88m1 。 注意事项： 1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。 3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡： A. 泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。 B. 从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。 C. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止 泡酸不彻底。 细胞培养用液的配制与消毒 器材与试剂： 干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 PH 计、磁力搅拌器。 具体步骤： 一、水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。 二、PBS 的制备与消毒 ( 也可用于其它 BSS ，如： Hanks ， D-Hanks 液的配制 ) ： 1.溶解定容：将药品（ NaCl 8.0g ， KCl 0.2g ， Na2HPO4·H2O 1.56g ， KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml ，摇匀即成新配制的 PBS 溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅 消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 ％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右）或 PBS （ D-hanks ）液中。搅拌混匀，置于 4℃ 内过夜。 2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（ 0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于 -20℃ 保存以备使用。 四、抗生素溶液的配制 1.所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅 高压 20 分钟灭菌。 2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位 / 瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位 / 瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。 3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml 。 1 单位＝ 1 微克？ 4.细胞库之细胞培养基不加抗生素 5.培养自ATC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 6.培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通 过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 7.寄送活细胞时，须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml) 8.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。 9.去除细菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml 注意混合使用后药物毒性会增强。 10.抗生素使用种类与浓度： 　　　　　　　　　　　工作浓度.　　　　 储存温度. 　　　　杀灭细菌 penicillin　　　　　　 100 units/ml 　　  -20℃ 　　　　G(+) bacteria streptomycin 　　　　　100 ug/ml　　　　  -20℃　　　　G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline　　　 50 ug/ml 　　　　  -20℃ 　　　　G(+) and G(-) bacteria gentamicin 　　　　　　50 ug/ml 　　　　  -20℃　　　　 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 　　　　2.5 ug/ml　　　    -20℃ 　　　　yeast and molds nystatin 　　　　　　　50 ug/ml　　　　   -20℃　　　　 yeast and molds fungizone 　　　　　　2.5ug/ml 　　　　   -20℃　　　　　 yeast and molds 五、RPMI1640 的制备与消毒： 1.溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 ( 冲洗液一并加入培养基中 ), 充分搅拌至粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后