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串联质谱技术 新生儿遗传代谢病筛查 上海市儿童医院 田国力 遗传代谢病 遗传性代谢病（遗传性代谢病（Inborn Errors of Metabolism,IEMInborn Errors of Metabolism,IEM）是由于基因改变导致某些酶或蛋白质功能发生质是由于基因改变导致某些酶或蛋白质功能发生质/量的量的改变，引起某些代谢途径上的生化物质发生改变引起改变，引起某些代谢途径上的生化物质发生改变引起一系列疾病。一系列疾病。大多数为单基因遗传病大多数为单基因遗传病 遗传方式以常染色体隐性遗传或遗传方式以常染色体隐性遗传或X X连锁隐性遗传为主连锁隐性遗传为主 遗传代谢病发病机制 异常代谢途径异常代谢途径 代谢物代谢物（A1）代谢物代谢物(C1)代谢物代谢物 (B1)代谢物代谢物（A2）代谢物代谢物(C2)代谢物代谢物(B2)代谢物代谢物(A)代谢物代谢物(B)辅酶（辅酶（C）正常正常代谢代谢途径途径 酶酶 疾病特点 目前已发现目前已发现500500余种疾病余种疾病 主要类型有氨基酸代谢障碍主要类型有氨基酸代谢障碍、有机酸血症有机酸血症、脂肪酸代谢障碍脂肪酸代谢障碍、核酸代谢异常核酸代谢异常症症、金属代谢障碍金属代谢障碍、线粒体病线粒体病 8080%属常染色体隐性遗传属常染色体隐性遗传 单病发生率低单病发生率低，群体患病率高群体患病率高 单基因缺陷所致代谢通路阻单基因缺陷所致代谢通路阻,大多为单基因遗传病大多为单基因遗传病，少数为线粒体基因遗传病少数为线粒体基因遗传病 表现非特异性表现非特异性，有赖遗传学或生化方法确诊有赖遗传学或生化方法确诊，代谢物代谢物、酶学和分子检测酶学和分子检测 常规试验检测：缺乏特异标志物常规试验检测：缺乏特异标志物 儿科儿科、血液科血液科、神经科神经科、骨科等不同诊室就诊骨科等不同诊室就诊 早期症状多无特异性早期症状多无特异性，累及部位和病情轻重差异很大累及部位和病情轻重差异很大，极易造成误诊极易造成误诊 新生儿期新生儿期、幼儿或儿童期发病幼儿或儿童期发病,某些可至成人期开始发病某些可至成人期开始发病。临床特征 多在新生儿期、幼儿或儿童期发病。某些可至成人期开始发病。多在新生儿期、幼儿或儿童期发病。某些可至成人期开始发病。新生儿期发病：呕吐、喂奶困难、反应力低下、呼吸暂停、急促等新生儿期发病：呕吐、喂奶困难、反应力低下、呼吸暂停、急促等 儿童期发病：可表现为全身多器官受累儿童期发病：可表现为全身多器官受累 以神经肌肉系统、呼吸系统、消化系统等症状为主以神经肌肉系统、呼吸系统、消化系统等症状为主 乏力、智力发育迟缓、肌张力增高或降低、癫痫、黄疸、肝脾肿大、乏力、智力发育迟缓、肌张力增高或降低、癫痫、黄疸、肝脾肿大、呼吸困难呼吸困难 代谢性酸中毒、容貌异常、毛发皮肤色素改变、特殊体味代谢性酸中毒、容貌异常、毛发皮肤色素改变、特殊体味 饮食、应激反应、体能消耗等为疾病急性发作诱因。饮食、应激反应、体能消耗等为疾病急性发作诱因。遗传代谢病诊断困难 临床症状和体征：缺乏特异性临床症状和体征：缺乏特异性 常规检测：缺乏特异标志物常规检测：缺乏特异标志物 特殊试验检测特殊试验检测 氨基酸分析：氨基酸自动分析仪，高效液相色谱氨基酸分析：氨基酸自动分析仪，高效液相色谱 酰基肉碱分析酰基肉碱分析 串联质谱技术串联质谱技术 气相质谱气相质谱技术技术 酶学分析酶学分析 基因诊断基因诊断 组织活检、成纤维细胞组织培养、脑脊液培养、其他神经病学检查组织活检、成纤维细胞组织培养、脑脊液培养、其他神经病学检查 PKU历史 体内高体内高PhePhe引起患儿引起患儿智力低下智力低下 19301930提出低苯丙氨酸提出低苯丙氨酸饮食治疗饮食治疗 19501950应用饮食治疗应用饮食治疗 仅对仅对PKUPKU同胞有益同胞有益 大多患儿出现不可逆大多患儿出现不可逆症状后才确诊症状后才确诊 19631963年美国新生儿年美国新生儿PKUPKU筛查筛查 Pediatrics,105:89,2000.重视遗传代谢病筛查与诊断 疾病谱的改变疾病谱的改变 感染性疾病、重度营养不良、肿瘤、先天畸形、遗传代谢性疾病感染性疾病、重度营养不良、肿瘤、先天畸形、遗传代谢性疾病 诊断技术的进步诊断技术的进步 生化检测、基因芯片、全基因组测序等生化检测、基因芯片、全基因组测序等 治疗方法的提高治疗方法的提高 替代治疗替代治疗、系谱分析系谱分析、遗传咨询遗传咨询、器官移植器官移植、基因治疗基因治疗 国内外对出生缺陷的重视国内外对出生缺陷的重视 新生儿遗传代谢病筛查 对新生儿遗传代谢缺陷、先天性内分泌异常以及某些严重对新生儿遗传代谢缺陷、先天性内分泌异常以及某些严重的遗传性疾病进行筛查的总称的遗传性疾病进行筛查的总称 患病新生儿在临床症状出现前能给予治疗，防止或减轻体患病新生儿在临床症状出现前能给予治疗，防止或减轻体格和智力发育障碍，避免痴呆或死亡的发生格和智力发育障碍，避免痴呆或死亡的发生 是当今国际上早期发现遗传代谢病患儿的有效措施是当今国际上早期发现遗传代谢病患儿的有效措施 是集筛查、早期诊断、及时治疗、预防再发等措施为一体是集筛查、早期诊断、及时治疗、预防再发等措施为一体 减少出生缺陷，提高人口素质减少出生缺陷，提高人口素质 是当今国际上早期发现遗传代谢病患儿的有效措施是当今国际上早期发现遗传代谢病患儿的有效措施 预防效果显著，成本效益最好预防效果显著，成本效益最好 新生儿遗传代谢病筛查 新生儿遗传代谢病筛查技术 细菌抑制法细菌抑制法:BIA:BIA 荧光法：荧光法：FIA,EFIAFIA,EFIA 免疫法：免疫法：ELISA,DELFIAELISA,DELFIA 串联质谱仪：一次检测，多种疾串联质谱仪：一次检测，多种疾病。检测氨基酸代谢异常，脂肪病。检测氨基酸代谢异常，脂肪酸代谢异常和有机酸代谢异常。酸代谢异常和有机酸代谢异常。Microarray platformMicroarray platform：分子基因：分子基因的研究，将的研究，将DNADNA点在玻璃芯片上，点在玻璃芯片上，然后与荧光标记的诊断探针反应，然后与荧光标记的诊断探针反应，检测响应荧光信号检测响应荧光信号 数字微流体数字微流体(Digital(Digital MicrofluidicsMicrofluidics):):用于溶酶体贮积用于溶酶体贮积病的筛查病的筛查 串联质谱筛查的优势 一种疾病一种疾病一种测试一种测试 多种疾病多种疾病多种测试多种测试 新生儿筛查方案的扩展新生儿筛查方案的扩展 将非常昂贵将非常昂贵 一份血样同时检测超过一份血样同时检测超过3030多种物质，近多种物质，近4040种种 代谢疾病。代谢疾病。高灵敏性、高选择性高灵敏性、高选择性 快速检测，达到早诊断、早治疗的效果快速检测，达到早诊断、早治疗的效果 降低了筛查诊断的假阳性和假阴性降低了筛查诊断的假阳性和假阴性 VS.传统筛查传统筛查 串联质谱串联质谱 MS/MSMS/MS是一种在同一样本中同时测量多种待测物的方法是一种在同一样本中同时测量多种待测物的方法 在同个测试平台上检测多个疾病就变得可能在同个测试平台上检测多个疾病就变得可能 质谱仪组成 MSMS仪主要由离子源、真空接口、质量分析器、检测器等仪主要由离子源、真空接口、质量分析器、检测器等四部分组成四部分组成 样品中被测物质在离子源内电离形成各种质荷比不同带样品中被测物质在离子源内电离形成各种质荷比不同带电离子（离子化），经真空接口进入由电场或磁场形成电离子（离子化），经真空接口进入由电场或磁场形成的质量分析器，利用电磁学原理，根据的质量分析器，利用电磁学原理，根据m/zm/z不同将带电不同将带电离子分开，最后到达检测器被检测，得到样品的质谱图离子分开，最后到达检测器被检测，得到样品的质谱图及离子强度及离子强度 质谱的基本原理 将分析物离子化为各种质荷比将分析物离子化为各种质荷比(m(m/z)z)不同的带电粒子不同的带电粒子 应用电磁学原理应用电磁学原理,带电粒子按带电粒子按m/zm/z在空间或时间上产生分在空间或时间上产生分离排列成的图谱离排列成的图谱 根据它们所形成的谱图、离子峰强度对分析物进行鉴定根据它们所形成的谱图、离子峰强度对分析物进行鉴定 若同时加入被检测物质对应的内标或外标，既可以进行定若同时加入被检测物质对应的内标或外标，既可以进行定量检测。量检测。MS/MSMS/MS的基本原理 两个两个MSMS经碰撞室经碰撞室(CID)(CID)串联而成串联而成 最常应用于最常应用于NBSNBS的是三重四极杆，由两个的是三重四极杆，由两个MSMS经碰撞室经碰撞室(CID)(CID)串联而成串联而成 一级一级MSMS是功能类似于气相和液相色谱的分离器，只允许是功能类似于气相和液相色谱的分离器，只允许选择的离子选择的离子(母离子母离子)通过通过 母离子进人母离子进人CIDCID产生碎片产生碎片(子离子子离子)子离子经二级子离子经二级MSMS选择最终进入检测器选择最终进入检测器 通过不同扫描的方式记录即可得到串联质谱图谱，通过不同扫描的方式记录即可得到串联质谱图谱，实现对实现对待测物的定性待测物的定性 通过样品中加入定量同位素内标，实现待测物定量检测通过样品中加入定量同位素内标，实现待测物定量检测 串联质谱仪 一级质谱 碰撞室 二级质谱 扫描特定范围离子或允扫描特定范围离子或允许特定离子进入碰撞器许特定离子进入碰撞器 分离器分离器 分子离子碰撞解离分子离子碰撞解离形形成成子离子子离子 扫描一定范围子离子选择扫描一定范围子离子选择特定子离子进入检测器特定子离子进入检测器 分析仪分析仪 串联质谱技术设备 串联四级杆质谱仪串联四级杆质谱仪 进样器进样器 高效液相泵高效液相泵 仪器控制及数据处理仪器控制及数据处理系统系统 串联质谱新生儿筛查的基本原理 遗传代谢病：由于遗传因素体内正常代谢途径受阻遗传代谢病：由于遗传因素体内正常代谢途径受阻 氨基酸代谢病患者血中氨基酸水平异常氨基酸代谢病患者血中氨基酸水平异常 有机酸血症及脂肪酸代谢障碍病患者血中游离肉碱或不同有机酸血症及脂肪酸代谢障碍病患者血中游离肉碱或不同种类的酰基肉碱水平异常种类的酰基肉碱水平异常 利用串联质谱仪通过检测检测滤纸干血片中氨基酸、游离利用串联质谱仪通过检测检测滤纸干血片中氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的水平肉碱及酰基肉碱的水平 通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来，综合判断多种遗传代谢病起来，综合判断多种遗传代谢病 一个测试平台上同时检测多个疾病一个测试平台上同时检测多个疾病 串联质谱新生儿筛查的步骤 采血后滴于专用采血滤纸片，晾干，制成滤纸干血片采血后滴于专用采血滤纸片，晾干，制成滤纸干血片 采用串联质谱技术，通过同位素内标法采用串联质谱技术，通过同位素内标法(IS)(IS)分析物和对应内标的响应比等比于分析物和对应内标的浓度比分析物和对应内标的响应比等比于分析物和对应内标的浓度比 一次性定量检测新生儿的滤纸干血片样品中的数十种氨基酸、酰基肉一次性定量检测新生儿的滤纸干血片样品中的数十种氨基酸、酰基肉碱浓度碱浓度 通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来，综合通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来，综合判断判断3030余种遗传代谢病余种遗传代谢病 衍生化氨基酸扫描质谱图 氨基酸氨基酸 m/z 同位素同位素 m/z Ala 146.0 Ala-d4 150.3 Leu 188.1 Leu-d3 191.2 Phe 222.2 Phe-d5 227.2 Tyr 238.2 Tyr-13C6 246.2 串联质谱检测指标 名称名称 缩写缩写 丙氨酸丙氨酸 AlanineAlanine AlaAla 精氨酸精氨酸 ArginineArginine ArgArg 瓜氨酸瓜氨酸 CitrullineCitrulline CitCit 鸟氨酸鸟氨酸 OrnithineOrnithine OrnOrn 苯