xb三、细胞工程的技术基础.ppt

第三章第三章 细胞工程的技术基础细胞工程的技术基础 2 第一节第一节 基本设备基本设备 第二节第二节 基本技术基本技术 3 第一节第一节 基本设备基本设备 一一 设备与器材设备与器材 二二 器材处理器材处理 4 一、设备与器材 大型设备类：无菌室、超净工作台、无菌箱、CO2培养箱、倒置显微镜、实体镜、高速离心机、超速低温离心机、冰箱、超低温冰箱、液氮装置。5 6 7 培养箱 8 9 10 光照培养室 11 12 显微镜室 13 14 15 16 17 18 19 20 消毒灭菌设备：蒸汽压力消毒器、电热干燥箱、过滤除菌装置、离子发生器、耐酸耐碱容器、吸管自动冲洗器、超声波清洗器；21 灭菌室 22 23 24 25 26 配液用具：水纯化装置、离子交换树脂装置、电子天平、磁力搅拌器、蒸发器等；制备、培养、保存细胞用品：解剖器具、80200目尼龙网或不锈钢网、血细胞计数板、培养器皿、细胞培养板（不同孔数）、涡流混悬器、恒温水浴振荡器、细胞冻存管、玻璃安瓿、真空低温干燥器、厚质玻璃容器等。27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 二、器材处理 玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗浸酸冲洗 橡胶用品的处理：冲洗碱煮冲洗浸酸冲洗蒸煮 清洗 除菌滤器的处理：高压灭菌 塑料器皿的清洗：冲洗碱浸冲洗酸浸冲洗漂洗 金属器械的清洗：汽油去脂洗净酒精擦蒸煮或高压灭菌 包装：包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃等，避免消毒后再污染；消毒灭菌：干烤、高压蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、射线、（甲醛）熏蒸消毒、化学消毒剂、抗生素消毒灭菌。37 一、无菌技术 1.各种灭菌方法及其适用范围 A 湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌法、常压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法）B 干热灭菌法（火焰灭菌、干热灭菌）C 电离辐射灭菌 D 紫外线杀菌 E 过滤除菌 F 化学杀菌 G 熏蒸灭菌法 第二节第二节 基本技术基本技术 38 2.无菌操作过程 A 清洗 玻璃器皿的清洗 实验材料的清洗 B 灭菌 培养材料的灭菌 以药剂灭菌法为主 主要考虑：药剂的灭菌效果、材料对药剂的耐受力 39 40 41 培养基灭菌 高压蒸汽灭菌 过滤灭菌 C 接种 经过表面灭菌的材料，按不同的要求，经过剪切、整理后，移植到培养基上培养的过程。接种室（无菌操作室）的灭菌 接种台的灭菌 工作人员注意事项 42 3.3.实验室生物安全实验室生物安全 概念：指那些用以防止发生病原体或毒素无意中暴露及意外释放的保护原则、技术及实践。传染性微生物的危险程度分4级 1级、2级、3级、4级 生物安全水平（BSL）相应的也分为4级 BSL 1（基础实验室）BSL 2（基础实验室）BSL 3（防护实验室）BSL 4（最高防护实验室）43 二、细胞制备：机械分散法 淋巴细胞分离：肝素抗凝血剂+Hanks 稀释 分级分离 吸取 加其它培养液 单细胞悬 胰蛋白酶 细胞 T、B细胞分离：尼龙棉柱过滤 B细胞粘附 液的制备 酶消化法 分离法 T细胞过滤 胶原酶 CD4/CD8细胞分离：SephadaG-10柱或 流式细胞分选仪 螯合剂分散法 单核/巨噬细胞分离淋巴细胞不粘，（与玻面粘附）单核/巨噬细胞粘附 44 三、细胞计数法：血细胞计数板或器 细胞分装；四、细胞培养与传代 五、细胞形态学检查法：一般形态观察 利用倒置显 普通染色观察（Giemsa染核）微镜观察法 特殊染色法：DNA（Feulgen反应）、DNA-RNA（甲基-派洛宁）、糖（PAS）、脂（苏丹红II）、线粒体（詹纳斯绿B液）、叶绿体（吖啶橙）45 吖啶橙：DNA、RNA 利用荧光显微镜观察法 扫描 免疫荧光染色 透射 利用电子显微镜观察法：扫描或透射。六、无血清培养液的设计和合成 七、细胞的冻存、复苏与运输 八、细胞培养的放大试验（生产）九、细胞培养时污染的检测、排除 46 本章内容到此结束本章内容到此结束 谢谢大家谢谢大家 欢迎研讨欢迎研讨 47【复习思考题复习思考题】一 常用的灭菌方法有哪几类？概述它们的原理。二 判断题：1.已经洗净的仪器可以用布或纸擦干。2.无菌操作一般要求在酒精灯火焰前10-20cm范围内进行。3.过滤除菌的适用对象是易被高温破坏的材料如抗生素、糖、激素等试剂。