TRIzol法同时提取RNA-DNA-蛋白质.doc

TRIzol法同时提取RNA,DNA,蛋白质 TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。 规格：100ml 黄色透明液体 储存条件：2-8℃避光保存12个月 注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。 预防RNase污染注意事项： 1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。 2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。 4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。） RNA的提取 准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 操作步骤: 1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。 b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。 7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。 8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。 10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。 注意事项： 1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。 3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。 预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为： 肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。 常见问题分析： 得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底 B．RNA沉淀未完全溶解 A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高 B．样品匀浆时加的试剂量太少 C．匀浆样品时未在室温放置5分钟 D．吸取水相时混入了有机相 E．RNA沉淀未完全溶解。 RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻 B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃ C.细胞在用胰酶处理时过度 D.溶液或离心管未经RNase去除处理 E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少 B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液 蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。 DNA的分离 准备试剂：乙醇 0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH 操作步骤: 1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。 2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。 3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟, 弃上清。 4. 室温放置晾干DNA 5-15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600μl 8mM NaOH，DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。 DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。 预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘2-3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5-7μg 成纤维细胞5-7μg 应用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板。 2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3-5单位的酶，80-90%的DNA是可消化的。 1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节 Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl) 8.4 86 7.2 23 8.2 93 7.0 32 8.0 101 7.8 117 7.5 159 注意事项： 1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。 2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存几个月。 3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃长期保存。 常见问题分析： 得率低：A.样品匀浆和裂解的不彻底 B．最终得到的DNA沉淀没有完全溶解 A260/A280<1.70 ：A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中 B．酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。 DNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻 B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃ C．样品匀浆时使用了高速匀浆仪 RNA污染：A.氯仿分层后水相去除的不干净 B．DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底 蛋白质的提取 准备试剂：异丙醇 含0.3M盐酸胍的95%乙醇 无水乙醇 1%SDS 操作步骤： 1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。 2．用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。 3．真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。 注意事项： 1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。 2．用0.1% SDS在2-8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。 常见问题分析： 得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底 B．最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解 蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充