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提问：提问：植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养植物组织培养,植物体细胞杂交植物体细胞杂交 这些技术的理论基础：这些技术的理论基础：植物细胞的全能性植物细胞的全能性 动物细胞全能性如何？动物细胞动物细胞全能性如何？动物细胞工程常用的技术有哪些？工程常用的技术有哪些？动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞融合动物细胞融合 单克隆抗体制备单克隆抗体制备 细胞核移植细胞核移植 动物动物细胞细胞工程工程技术技术 动物细胞工程的基础动物细胞工程的基础 2.2.1动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养和核移植技术 教学目标教学目标 简述动物细胞培养的过程简述动物细胞培养的过程、条件条件及应用及应用。简述通过动物体细胞核移植技术简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景克隆动物的过程和应用前景。重点重点 动物细胞培养的过程及条件。动物细胞培养的过程及条件。用动物体细胞核移植技术克隆动物用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。的过程。难点难点 用动物体细胞核移植技术克隆动物用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。的过程。重点难点重点难点 皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，合过程中为保护创面而采取的措施，10101414天后就天后就要被身体排斥。要被身体排斥。如果一个大面积烧伤的病人来说，自体如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？才能获得大量的自体健康皮肤？烧伤病人图片烧伤病人图片 异体皮肤移植图片异体皮肤移植图片 为什么要进行动物细胞培养?人耳鼠“人耳鼠人耳鼠”再出风头再出风头 20012001年，一只特别的活老鼠在年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动北京引起轰动这是有着一对红这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的一般大小的“人耳人耳”。这只老鼠背。这只老鼠背上的上的“人耳人耳”是由上海市第九人民是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的教授利用组织工程技术复制出来的。在京展出的数天，尽管门票高达在京展出的数天，尽管门票高达2020元，但还是有将近元，但还是有将近2020万人，心甘情愿地掏钱一睹万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠人耳鼠”的风采。的风采。人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？1、概念、概念 是指从动物机体内取出相关的是指从动物机体内取出相关的组组织织，将它分散成，将它分散成单个细胞单个细胞，然后放，然后放在适宜的在适宜的培养基培养基中，让这些细胞中，让这些细胞生生长长和和增殖增殖。2、原理、原理 细胞分裂增殖细胞分裂增殖 一、动物细胞培养一、动物细胞培养 如何进行细胞培养如何进行细胞培养?（一）、动物细胞培养过程（一）、动物细胞培养过程 幼龄动物幼龄动物 剪碎组织剪碎组织 原代细胞培养原代细胞培养 取动物器官取动物器官 和组织和组织 细胞悬浮液细胞悬浮液 传代细胞培养传代细胞培养 胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理 单个细胞单个细胞 胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理 单个细胞单个细胞 1、有关概念有关概念:（1 1）、原代培养：）、原代培养：将动物组织消化后的初次将动物组织消化后的初次 培养。培养。（分瓶前）（分瓶前）（2 2）、传代培养：）、传代培养：将贴满瓶壁的需要重新用将贴满瓶壁的需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。这样的培养过程称为传代培养胞继续增殖。这样的培养过程称为传代培养。（分瓶后）（分瓶后）在传代培养过程中在传代培养过程中 10代以前的代以前的细胞核型不变细胞核型不变 1050代，增殖逐渐减慢，以至于完全停代，增殖逐渐减慢，以至于完全停止，部分细胞的止，部分细胞的细胞核型可能发生改变细胞核型可能发生改变 50代以后的部分细胞发生突变，获得不死代以后的部分细胞发生突变，获得不死性，朝着等同于癌细胞的方向发展。性，朝着等同于癌细胞的方向发展。应用：目前应用：目前使用的使用的或或冷冻保存的冷冻保存的正常细胞通常正常细胞通常为为1010代以内代以内，以保持细胞，以保持细胞正常的二倍体核型正常的二倍体核型。有关概念有关概念 （3 3）、）、细胞株：细胞株：10到到40、50代的细胞，代的细胞，遗传物质没发生改变。遗传物质没发生改变。（4 4）、细胞系：）、细胞系：超过超过50代的细胞，代的细胞，遗传物质发生改变，可无限增殖。遗传物质发生改变，可无限增殖。细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别：细胞系的细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。去接触抑制，容易传代培养。细胞细胞悬浮悬浮液液 1010代代细胞细胞 5050代代细胞细胞 无限传无限传代代 原代培养原代培养 传代培养传代培养 细胞株细胞株 细胞系细胞系 如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？多数组织细胞固定在表面生多数组织细胞固定在表面生长和分裂长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖 遗传物质改变遗传物质改变 取动物动取动物动的组织块的组织块 胰蛋白酶胰蛋白酶 剪碎剪碎 单个单个细胞细胞 加培加培养液养液 细胞细胞悬液悬液 接触接触 抑制抑制 部分细胞“癌部分细胞“癌变”，无限传代变”，无限传代 动物细胞培养不能动物细胞培养不能 最终培养成动物体最终培养成动物体 10代代细胞细胞 原代培养原代培养 传代培养传代培养 细胞贴壁细胞贴壁 胰蛋白胰蛋白酶处理、酶处理、细胞株细胞株 细胞细胞 细胞系细胞系 2、动物细胞培养过程：、动物细胞培养过程：50代代细胞细胞 培养瓶培养瓶适宜条适宜条件培养件培养 分瓶分瓶培养培养 归纳归纳 过程过程 取取 的组织、器官的组织、器官 细胞悬浮液细胞悬浮液 酶酶 贴满瓶壁的细胞贴满瓶壁的细胞 单个细胞单个细胞 加入加入 液液 动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物 胰蛋白胰蛋白 培养培养 接触抑制接触抑制 原代原代 培养培养 1-10代细胞代细胞 遗传物质遗传物质 改变改变 原代细胞原代细胞 培养培养 加加 液液 4050代细胞代细胞(细胞株细胞株)未未 遗传物质遗传物质 改变改变 无限传代（无限传代（细胞系细胞系）已已 传代传代培养培养 胰蛋白胰蛋白 酶酶 强调一：细胞贴壁过程强调一：细胞贴壁过程 细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培培养瓶或培养皿壁要求：养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易表面光滑、无毒、易于贴于贴 附。附。当当贴壁细胞分裂生贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。细胞的接触抑制。强调二：接触抑制强调二：接触抑制 思考题：思考题：1 1、选用健康动物体内什么样的组织块做细胞培养、选用健康动物体内什么样的组织块做细胞培养材料？为什么？材料？为什么？因为这些组织或器官，分裂能力因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。旺盛，易于培养。动物胚胎或幼龄个体的器官或组织动物胚胎或幼龄个体的器官或组织 拓展拓展-动物组织或细胞培养的难易程度动物组织或细胞培养的难易程度 幼体组织或细胞幼体组织或细胞 老龄组织或细胞老龄组织或细胞 分化程度低的组织或细胞分化程度低的组织或细胞 分化程度高的组织分化程度高的组织 或细胞或细胞 肿瘤组织或细胞肿瘤组织或细胞 正常组织或细胞正常组织或细胞 3、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？的物质是什么成份？催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质白质(胶原蛋白等胶原蛋白等)。4、细胞膜的主要成份是什么？、细胞膜的主要成份是什么？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂 成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。培养。2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？6 6、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？7 7、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？注意时间的控制注意时间的控制 不能，因为两者的最适不能，因为两者的最适PHPH不同，而正常组织不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PHPH较接近较接近 5、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？能能 归纳归纳 过程过程 取取 的组织、器官的组织、器官 细胞悬浮液细胞悬浮液 酶酶 细胞贴壁、细胞贴壁、接触抑制接触抑制 培养培养 1010代细胞代细胞 培养培养 细胞株细胞株 无限传代无限传代 细胞系细胞系 单个细胞单个细胞 加加 液液 遗传物质遗传物质 改变改变 遗传物质遗传物质 改变改变 动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物 胰蛋白胰蛋白 培养培养 原代原代 传代传代 未未 已已 50代细胞代细胞 多细胞动物和人体的细胞多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所都生活在内环境中，根据你所学的知识，思考并讨论下列问学的知识，思考并讨论下列问题？题？1、体外培养细胞时需要哪些、体外培养细胞时需要哪些提供那些物质？提供那些物质？2、体外培养的细胞需要什么、体外培养的细胞需要什么样的环境条件？样的环境条件？1 1、无菌、无毒的环境（先对、无菌、无毒的环境（先对培养液培养液、培养器具培养器具无菌处理；添加一定量的无菌处理；添加一定量的抗生素抗生素，防止污染；，防止污染；定期定期更换培养液更换培养液，清除代谢产物清除代谢产物)2 2、营养、营养 糖糖（葡萄糖）、（葡萄糖）、氨基酸氨基酸、促生长因子促生长因子、无机无机盐盐和和微微 量元素量元素等（合成培养基）；等（合成培养基）；通常需加通常需加血清或血浆血清或血浆等天然成分。等天然成分。（二）（二）动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件 与植物培养基相比其特点是：与植物培养基相比其特点是：（1 1）液体培养基液体培养基 （2 2）含有动物血清含有动物血清 动物体细胞大都生活动物体细胞大都生活在在液体液体的环境的环境 3、温度和、温度和PH 36.5+（-）0.5度,7.2-7.4 4、气体环境：、气体环境：O2和和CO2（95%空气和空气和5%CO2）提醒提醒 CO2 2作用作用调节培养基调节培养基pH;O2 2作用作用细胞有氧呼吸，细胞代谢必需细胞有氧呼吸，细胞代谢必需 所用装置所用装置 培养皿或松盖培养瓶培养皿或松盖培养瓶+培养箱。培养箱。植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较 比较项