methuosis是一种新的蛋白酶独立细胞死亡的形式.doc

对吲哚类查耳酮作为新型非细胞凋亡形式——Methuosis的诱导剂的合成和评价 methuosis是一种新的蛋白酶独立细胞死亡的形式，从胞吞胞吐派生的空泡的大量积累，最终导致细胞脱离底层和破裂。最近，我们描述了1查耳酮化合物，3 - （2 - 甲基-1H-吲哚-3 - 基）-1 - （4 - 吡啶基）-2-丙烯-1-（即，MIPP），它可以诱导methuosis在神经母细胞瘤和其他类型的癌细胞发生。在此，我们描述了直接相关化合物库的合成及构效关系，提供了深入了解两个芳环系统的贡献，并强调了一个强有力的衍生物，3 - （5 - 甲氧基-2 - 甲基-1H-吲哚-3 - 基）-1 - （4 - 吡啶基）-2-丙烯-1-（即，MOMIPP）在微摩尔浓度这样低的浓度下可诱导methuosis。我们也分析了叠氮衍生物的生物活性，可能有助于旨在用光亲和标记技术鉴定蛋白质目标MOMIPP的未来研究。这些研究的潜在意义通过发现MOMIPP有效地降低了替莫唑胺耐药性胶质母细胞瘤和阿霉素耐药乳腺癌细胞的生长活性而不断被重视。因此，它可能可以作为一种能够在癌症中通过methuosis形式来促进细胞凋零的药物原型，这种原理与传统细胞死亡（如细胞凋亡）的机理不同。 介绍 尽管在发展中国家针对特有的某些类型的癌症细胞的调控途径的治疗药物有了最新进展，许多肿瘤术后辅助治疗的重要支柱仍然是辐射和DNA烷化剂。一个例子是高度恶性脑肿瘤，胶质母细胞瘤（GBM），在现行标准的护理是手术，在可能的情况下，也会有辐射和口服替莫唑胺（TMZ网站）的辅助治疗。（1）后者方法的一个限制是，他们以通过破坏DNA而引发内在的凋亡途径的形式工作。（2）由于GBM细胞通常在海港抑癌基因的突变（例如，PTEN，P53，PRB），他们是相对不敏感的凋亡刺激。（3，4）此外，胶质母细胞瘤细胞通过提高他们修复DNA损伤的能力而获得对烷化剂的抗药性。（5）我们相信，有可能开发新的方法通过诱导可替代的非细胞凋亡的细胞死亡形式来治疗这类有抗药性的癌症，这种细胞死亡形式不以DNA损伤作为触发。为此，我们定义了一个独特的细胞死亡的形式称为“methuosis”（6,7） methuosis的特点是大部分细胞的细胞质空间以从macropinosomes派生空泡形式产生位移。（6）后者当膜皱褶（伪足）附上许多口袋状细胞外液，并内化时形成。在methuosis（8，9），回收的减值和溶酶体导向贩运macropinocytotic囊泡的作用把他们锁定在中间阶段，在此他们融合而逐步形成较大的液泡。这最终导致代谢活动减少，细胞膜破裂。（6）这种死亡被认为是非细胞凋亡形式，因为其并非伴随着核染色质浓缩，细胞出泡，或核小体DNA片段。methuosis也是caspase独立的，因为它不能被广谱蛋白酶抑制剂如ZVAD-FMK阻止。 Methuosis本质特点在于GBM细胞，它是被激活的Ras和Rac GTP酶异位表达而触发这种形式的细胞死亡的场所。然而，利用这种非常规的细胞死亡途径杀死那些不易细胞凋亡的癌细胞的潜力取决于分子是否可以诱导methuosis druglike属性识别。最近，我们描述了一个原型查耳酮相关化合物，它能在抗TMZ和非抗GBM细胞以及来自乳腺癌，结肠癌，胰腺的其他癌症细胞系以带有methuosis的特征形式来诱导细胞死亡（10）。在此，我们报告了相关化合物库合成及构效关系（SAR）的研究从而导出（1）定义的主要特点，为诱导methuosis 活动，（2）确定改进生物活性的衍生物以及发展一个可能适合在未来目标识别工作中用作光亲探测器的叠状类似物做准备。 结果 SARs 由于我们开始寻求可能引发methuosis的 druglike小分子，我们注意到Kirchhausen和同事（11）写的一个报告，他们描述了被称为vacuolin-1的分子及一些其他三嗪类化合物，这些化合物能够抑制Ca2+依赖溶酶体胞吐。虽然这些化合物能诱导标记的细胞空泡化，他们并没有引起细胞死亡。然而，在本报告中包含的信息中，一种结构独特的诱导液泡的化合物我们的注意，因为它相似的一类分子称为查耳酮。这种化合物的结构被描绘在图1（化合物1）。查耳酮由一个1,3 - 二苯基-2 - 丙烯-1框架组成，这种框架是黄酮类天然产物的前体组成。然而，查耳酮已长期被广泛应用于描述许多在此框架内建立的合成衍生物。几种查耳酮（12）已发现有显着的抗癌活性，但尚未被报道能诱导细胞空泡化。（12-14 ）这促使我们怀疑化合物1可能代表了一种新型的查耳酮，它可以通过诱导methuosis杀死癌细胞。我们发现，化合物1几个小时内在胶质瘤细胞引起广泛空泡，48小时内造成细胞活力的重大损失。（10）化学数据库的检索发现了相似性> 75％的其他化合物。其中，化合物2（图1）被选定做进一步研究。它引起的空泡比化合物1引起的更大、更多。化合物2被分配的缩写是MIPP，即3 - （2 - 甲基-1H-吲哚-3 - 基）-1 - （4 - 吡啶基）-2-丙烯1。 MIPP的生物效应的详细评价表明，这种化合物诱导细胞死亡的形式与methuosis的数据图表相匹配。（10）此外，MIPP在抑制对TMZ有高抗的GBM细胞的生长和活力方面也非常有效。（ 10） Figure 1. Structures of compounds 1 and 2, initially found to be active inducers of methuosis(10) as compared with commercially available analogues 3–8, which failed to induce the hallmarks of methuosis in culture U251 GBM cells. 因为需要MIPP的浓度≥10μM才能有效诱导methuosis，所以我们开始组装MIPP相关化合物库，并与经效能提高的确定的目标类似物进行初步特区的比较。 我们首先从比较MIPP和市售的几个相关化合物（图1化合物3-8）诱导methuosis的活性开始。当在U251 GBM细胞中添加浓度为10μm时，后者没有触发细胞空泡化。1-8化合物（图1）的检验表明，吲哚和吡啶环之间的特有关系很可能在一些特定活动中起到重要作用。具体来说，化合物1（有效）与化合物7（无效）的比较表明吡啶环的重要性，因为当用段 - 甲氧基苯基环化合物来代替它时呈现无效。因此，一种类似物的初始构成被合成，以用来研究调查吡啶氮的位置对生物活性的影响。 α，β-不饱和酮的核心基础类似物可以由吲哚-3 - carboxaldehydes和芳酮的Claisen-Schmidt缩合制备。（15）苯乙酮或各种乙酰吡啶，吲哚-3 - 甲醛的缩合反应产生化合物9-12（图1A）。这些化合物按照三个标准与浓度为10μM的MIPP进行了活性比较：（1）在24和48 h借助相差显微镜进行活细胞的形态空泡评估; （2）48小时时结束用3 - （4,5 - 二甲基-2 - 基）-2,5 - 二苯基溴化四唑（MTT）法对细胞存活率评估，并在第一个24小时;后添加新鲜化合物。（3）48小时暴露在这些化合物中的细胞上显示细胞集落形成方式（2周为限）。这一分析结果（见表1）表明，第一个吡啶环的氮取向是其是否具有活性的一个关键特征。元和正射类似物10和11，以及苯乙酮类似物9，均在诱导methuosis方面与MIPP相比相对无效。相比之下，去除MIPP吲哚环（化合物12）2 - 甲基，虽减少但并未消除活性。 Scheme 1. Synthesis of Analogues of MIPP (Compound 2)a aThe specific substituents at R1, R2, R3, and Ar for each numbered compound are listed in the chart. For A–D, the specific conditions and reagents were as follows: (A) piperidine, CH3OH, reflux, 19–89%. (B) BBr3, CH2Cl2, −78 °C, 61 and 95% for 15 and 21, respectively. (C) POCl3, DMF, 0 °C, 90%; piperidine, CH3OH, reflux, 89%. (D) NaH, CH3I, DMF, RT, 82%. Table 1. Summary of SAR Studies Performed on MIPP (Compound 2) and Related Compounds Generated in Schemes 1 and 2 Table * Results are expressed as percent of controls that received vehicle alone (DMSO). Values are the mean ± SD of quadruplicate (MTT) or triplicate (colony formation) determinations. 接下来，我们分别用市售5 - 甲氧基和5 - 苄氧基吲哚-3 –甲醛准备化合物13和14来探索吲哚环的5位上基团的官能团作用。5 - 甲氧基化合物13，反过来用BBr3甲基化形成5-OH的化合物15（图1B）。如表1所示，尽管他们在短期的增长/可行性实验中细胞毒性不一致。但当在集落形成实验和细胞形态方面比较时,化合物13和14的活性类似MIPP。相比之下，5 - 羟基取代化合物15在所有的检测中表现出的生物活性却大大降低。为了确认吡啶氮的位置仍然是5 - 甲氧基取代的化合物活性的关键，类似物16和17被分析。若其失去活性则证实吡啶氮（见表1）的必要性。 因为比较化合物12-15与MIPP表明吲哚环5位和2位的改变都会影响活性，我们从市售2 - 甲基-5 - 甲氧基吲哚出发合成了2 - 甲基-5 - 甲氧基类似物。我们通过Vilsmeier-哈克甲酰化2 - 甲基-5 - 甲氧基吲哚合成了关键中间体18，接着与4 - 乙酰吡啶耦合出化合物19（图1C）。无论是在MTT法的可行性分析还是在克隆形成实验中，这种化合物的抑制活性超过MIPP（见表1）。此外，甲基吲哚氮的化合物13与NaH/CH3I在二甲基甲酰胺（DMF）（计划1D）制造20时产生了一种化合物，它能诱发一些胞质空泡化，但只有温和影响细胞活力（见表1）。因此，比较化合物13，19和20后，我们明白当吲哚1、2位分别被H和甲基占用时，其取得最佳的活性。5-OH的化合物21，由BBr3去甲基化的19（1B计划）形成，与5 - 甲氧基化合物19（见表1）相比，其表现出在活性上的显着降低与先前观察到的5-OH在化合物15的不利效果一致。 在生理条件下使用MIPP的局限性之一是其在水溶液中始终有一定溶解度。因此，我们做了一组在生理PH时增加极性的实验，用来探讨改变过的吲哚5位基团所带来的影响。因为我们以前的SAR研究表明，吲哚环的5位基团有一定随机性（比较化合物13和14），所以我们设计了一个14的类似物，增加了电荷和吲哚2位上的一个甲基。我们设想，OH类似物21可被甲基4 - （溴甲基）苯甲酸烷基化，然后被其酸水解，从而产生一种在pH=7.4时的高水溶性类似物。然而，我们有些诧异，没有明显的产品，可以由21直接烷基化生产。我们在不同pKa值的多个基地进行了筛选，从K2CO3到Cs2CO3，以及乙胺，tetramethylguanidine，1,8 - 二氮杂双环[5.4.0]-螺-7烯（DBU），氢化钠。我们在所有的反应中对在吡啶氮发生的烷基化反应进行了观察。强如TM