6酶、细胞、原生质体固定化.ppt

第二章第二章 酶与细胞的固定化酶与细胞的固定化 固定化生物技术固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。复利用。1.1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。机溶剂对其有影响）。2.2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。3.3.分离纯化困难。分离纯化困难。游离酶的缺点：游离酶的缺点：一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点 1.1.固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme)固定在载体上并在一定空间范围内进行催固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。化反应的酶。第一节第一节 酶与细胞的固定化酶与细胞的固定化 什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶 水不溶性载体水不溶性载体 水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术 优点：优点：(1)(1)可提高稳定性。可提高稳定性。(2)(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。能回收，易与产物分离，可反复使用。缺点：缺点：(1)(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)(2)酶活性下降。酶活性下降。2.2.固定化细胞（固定化细胞（immobilized cellimmobilized cell）固定在载体上并在一定空间范围内进行固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。优越性：优越性：(1)(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作降低成本，省去酶的分离纯化工作;(2)(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。完成部分代谢过程。局限性：局限性：(1)(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。产物。(2)(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。作用。3.3.固定化原生质体固定化原生质体 意义意义：(1)(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。胞内产物的分泌。(2)(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高由于载体的保护作用，稳定性提高。二、固定化方法二、固定化方法 固定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法（一）酶的固定化方法 吸附法吸附法 共价偶联法共价偶联法 交联法交联法 包埋法包埋法 网格型网格型 微囊型微囊型 离子交离子交 换吸附换吸附 物理物理 吸附法吸附法 依据带电的酶或细胞和载体之间的静电依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。换剂上。1.1.吸附法（吸附法（adsorptionadsorption）根据吸附剂的特点分根据吸附剂的特点分:1 1）物理吸附法（）物理吸附法（physical adsortionphysical adsortion）作用力：作用力：氢键、疏水键氢键、疏水键 常用载体：常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、活性碳等。硅胶、羟基磷灰石、纤维素、活性碳等。2 2）离子结合法（）离子结合法（ion bindingion binding）作用力：作用力：离子键离子键 常用载体：常用载体：DEAEDEAE-纤维素、纤维素、DEAEDEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CMCM-纤维素纤维素 优点：优点：条件温和，操作条件温和，操作简便，酶活力损失少。简便，酶活力损失少。缺点：缺点：结合力弱，易解结合力弱，易解吸附吸附。借助共价借助共价键将酶的活性键将酶的活性非必需侧链基非必需侧链基团和载体的功团和载体的功能基团进行偶能基团进行偶联。联。2.2.共价偶联法（共价偶联法（covalent binding covalent binding or covalent couplingor covalent coupling）1 1）载体：亲水载体优于疏水载体）载体：亲水载体优于疏水载体 如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好亲和性好，机械性能差机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物：聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好机械性能好，但有疏水结构但有疏水结构 尼龙尼龙 2 2）偶联方法：）偶联方法：偶联成功与否取决于：偶联成功与否取决于：载体：载体：功能基团：芳香氨基，羧基，功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。羧甲基等。酶分子酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。基，羟基，酚基，咪唑基。常用的偶联反应有：重氮化法、常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。易脱落，可连续使用。缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。的空间构象而影响酶的催化活性。3.3.交联法（交联法（crosslinkingcrosslinking）借助双功能试剂使酶分子之间发生交借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。联的固定化方法。双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O O H C CH2 CH2 CH2 C H 戊二醛有两戊二醛有两个醛基，均可与个醛基，均可与酶或蛋白质的游酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应,使酶使酶蛋白交联。蛋白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键，此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：不同之处：交联法不使用载体。交联法不使用载体。交联反应既能发生在分子间，也可发生交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。在分子内。酶浓度低时酶浓度低时，交联发生在分子内交联发生在分子内，酶仍保酶仍保持溶解状态持溶解状态。酶浓度高时酶浓度高时，交联发生在分子间交联发生在分子间，酶变为酶变为不溶态不溶态。缺点：缺点：(1)(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。被交联，酶活力损失大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。带来不便。4.4.包埋法（包埋法（entrapmententrapment）将酶用物理的方法将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚包埋在各种载体（高聚物）内。分为：物）内。分为：网格型：网格型：将酶包埋在高将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。分子凝胶细微网格中。微囊型：微囊型：将酶包埋在高将酶包埋在高分子半透膜中。分子半透膜中。1）网格型包埋法网格型包埋法 （gel(lattic)entrapmentgel(lattic)entrapment）又称凝胶包埋法又称凝胶包埋法 凝胶凝胶 包埋条件包埋条件 酶活性酶活性 强度强度 天然凝胶天然凝胶 琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶 温和温和 不变不变 差差 合成凝胶合成凝胶 聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂 聚合反应聚合反应 部分失活部分失活 高高 使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点 海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法：滴至滴至 海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC)角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包埋法：滴至滴至 角叉菜胶角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中溶液中 IE(or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法：AP Acr+Bis+E(or cell)IE(or IC)TEMED 2 2）微囊型包埋法）微囊型包埋法 （microencapsulationmicroencapsulation）又称半透膜包埋法又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约百微米，厚约25nm25nm。半透膜孔径半透膜孔径 80%80%活性。活性。（三）酶的最适温度三）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升多数酶固定化后热稳定性上升，最适温最适温度也上升度也上升（有例外有例外）。（四）酶的最适（四）酶的最适pHpH 带负电荷载体带负电荷载体 ：最适：最适pH pH 向碱性偏移。向碱性偏移。带正电荷载体带正电荷载体 ：最适：最适pH pH 向酸性偏移。向酸性偏移。0 010102020303040405050606070705 56 67 78 89 9pHpHRelative activity(%)Relative activity(%)A AB B 固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数K Km m随载体的带电随载体的带电性能变化。性能变化。固定化载体与底物电荷相反固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的固定化酶的表观表观K Km m值降低。值降低。固定化载体与底物电荷相同固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的固定化酶的表观表观K Km m值显著增加。值显著增加。（五）酶的动力学特征（五）酶的动力学特征 与自然酶基本相同。但大分子底与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。发生改变。（六）酶的作用专一性（六）酶的作用专一性 与固定化酶相比，固定化细胞的情与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。况比较复杂。（1 1）有活性升高的现象。）有活性升高的现象。（2 2）稳定性的增加）稳定性的增加 。（3 3）最适温度和最适）最适温度和最适pHpH常保持不变。常保持不变。二、固定化细胞的性质二、固定化细胞的性质 (一一)酶酶(细胞细胞)的活力的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。化酶。(二二)蛋白总量蛋白总量 1.1.双辛可宁酸法双辛可宁酸法(BCA(BCA法法)2.2.考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 三、固定化酶（细胞）的评价指标三、固定化酶（细胞）的评价指标 (三三)偶联率及相对活力偶联率及相对活力 偶联率偶联率=(=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/)/加入蛋白活力加入蛋白活力100%100%活力回收活力回收=固定化酶总活力固定化酶总活力/加入酶的总活力加入酶的总活力100%100%相对活力相对活力=固定化酶总活力固定化酶总活力/(/(加入酶的总活加入酶的总活力力-上清液中未偶联酶活力上清液中未偶联酶活力)100%100%(四四)半衰期半衰期 在连续测定条件下，固定化酶在连续测定条件下，固定化酶(细胞细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以工作时间，以t t1/21/2表示。表示。是衡量稳定性的一项重要指标。是衡量稳定性的一项重要指标。不同固定化方法的比较不同固定化方法的比较 carriers Recovery of enzyme activity(%)Agar 54.0 po1yacrvlamlde l5.24 Gelatin 40.77 carragheenan 69.13 Glutaraldehyde 0 乙酰乙酰-DL Ala L Ala+乙酸乙酸 乙酰乙酰-D Ala 第三节第三节 固定化酶与固定化细胞的应用固定化酶与固定