Calcein-AM和PI鉴别死活细胞.docx

PI可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色 钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein -AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein -AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein -AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。因此Calcein -AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm）。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定PI和Calcein -AM的合适浓度。   I．试剂  Calcein-AM   PI    II．用荧光显微镜观察细胞形态    以HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。  １．染色溶液的配制   1）用1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM，制备成1 mmol/l 的Calcein-AM储备液，-20℃下密闭冷冻保存。   2）用1 ml ddH2O溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/l的PI储备液（1 mg PI/1 ml H2O），-20℃下密闭冷冻保存。   3）将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。   4）加10 μl Calcein-AM储备液和15μl  PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。    Calcein-AM的终浓度为2 μmol／l，PI的终浓度为4μmol／l。    2．细胞染色   1）染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。       2）将细胞悬液离心3分钟(1,000 rpm)。   3）去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至105 –106 个／ml。再用移液器充分混匀。   4）由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。   5）将200 μl细胞悬液移至小试管中，加入100 μl染色溶液，在37℃下孵育15分钟。   6）在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。   7）在荧光显微镜下，先使用490±10 nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。  *在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。   *Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。    3．染色试剂的最佳浓度   Calcein-AM和PI的最适浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。   1）通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。   2）用0.1-10 μM 的PI溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。   3）用0.1-10 μM 的Calcein-AM溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的Calcein -AM浓度。接着用该浓度的Calcein -AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。