973-2010CB945400-干细胞向生殖细胞诱导分化的调控机理及应用性研究.doc

项目名称： 干细胞向生殖细胞诱导分化的调控机理及应用性研究 首席科学家： 松阳洲 中山大学 起止年限： 2010年1月-2014年8月 依托部门： 教育部 一、研究内容 本项目将以胚胎干细胞及诱导多能干细胞（iPS）为技术平台，研究哺乳动物干细胞向生殖细胞分化以及生殖细胞减数分裂的调控网络和机理，并建立研究生殖细胞分化所需的生物技术平台及多种细胞及小鼠模型，从而提高干细胞向生殖细胞诱导分化的效率，为大型经济动物优质培育奠定基础。 （1）利用蛋白质组学，BiFC组学, 信息学研究平台，建立以PGC关键调控元为中心的信号调控网络，筛选控制PGC基因表达的关键因子，并阐述端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向PGC诱导分化过程中的作用机理。同时利用表观遗传学研究技术，分析PGC诱导过程中组蛋白修饰的动态过程和不同修饰与PGC发育之间的相互关系。探讨以上关键信号调控网络、关键因子在诱导牛干细胞向生殖细胞分化过程中的调控机理。 (2) 利用基因组学、蛋白质组学研究技术，系统地分析精原干细胞和胚胎干细胞的特异性差异。阐明雄性生殖细胞中诱导减数分裂的分子机制，建立干细胞体外诱导分化雄性生殖细胞的理论体系，并分析体外生成生殖细胞的生物学功能。 (3)以人及小鼠胚胎干细胞体外分化系统为模型，优化PGC特化的条件，并通过转基因及基因敲除的方法，探索关键转录因子及信号网络在PGC形成过程中的功能及调控机理。 (4)建立较为完善的牛ES细胞体外培养体系，探讨牛干细胞自我更新和分化途径。通过转基因技术、选择合适的生长因子、转录因子和培养体系诱导牛ES细胞分化为雄性生殖细胞，并建立相应的技术平台。 二、预期目标 总体目标 本项目以研究诱导分化技术、蛋白调控网络、减数分裂机理及农业经济动物培育为主线，紧密围绕以上3个拟解决的关键科学问题。在建立的多种技术平台的基础上，确立以PGC关键调控元为中心的信号调控网络，筛选控制PGC基因表达的关键因子。系统地分析精原干细胞与胚胎干细胞之间特异性差异，阐明雄性生殖细胞中诱导减数分裂的分子机制。同时，建立体外诱导培养功能性生殖细胞的技术体系，以小鼠为主要研究对象，尝试应用干细胞诱导产生的生殖细胞来培育优化动物，最终确立我国在这一极富竞争性的前沿探索领域的领先地位。 五年预期目标 1，发展基于干细胞学和生殖细胞学研究的一整套方法和综合技术平台。 2，建立以PGC关键调控元为中心的较为完整的信号调控网络，筛选出控制PGC基因表达的几个关键因子。 3，明确端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向PGC诱导过程中的作用机理，并揭示组蛋白修饰的动态过程和不同修饰与PGC发育之间的相互关系。 4，明确精原干细胞和胚胎干细胞之间的基因表达差异，确定3-6个差异表达基因。5，阐明雄性生殖细胞中诱导减数分裂的分子机制。 6，建立一整套诱导PGC生成的培养体系。 7，建立1-3个体外培养生长状况良好、表达干细胞标记的牛ES细胞系，初步阐明牛干细胞自我更新和分化的可能途径。 8，力争建立牛ES细胞体外诱导分化形成功能性配子（精子、卵子）的技术体系。 9，在国际重要学术刊物上发表高水平论文40篇以上。其中影响因子大于10的论文8篇以上。 10，培养一批从事干细胞研究的交叉学科人才。 11，主办一次生殖细胞学研究的国际性学术研讨会。 12，申请发明专利10项以上。 三、研究方案 1，总体思路 干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。 干细胞的功能则是通过细胞内外因子对蛋白质组和基因组的动态调控来实现的。 因此探讨干细胞生长微环境、蛋白质间相互作用、组蛋白修饰与基因表达之间的相互关系，并依此建立干细胞向生殖细胞分化的调控蛋白质网络和定向诱导技术体系将是本项目的重要研究方向。 2，技术途径 根据以上的学术思路，本项目的总体研究技术途径如图2所示。具体地，本项目将首先建立能够系统挖掘生殖细胞靶蛋白及其体外诱导分化的技术手段与平台，包括：蛋白质组学平台、蛋白质BiFC表达库和RNAi库、生物信息学技术平台和动物模型技术平台。通过这些平台，系统地发现与生殖细胞分化相关的调控网络，并进一步利用现代分子生物学、细胞培养等技术确定一些蛋白质的靶蛋白网络和功能以及调控机理。在这些基础研究的基础上，进一步以小鼠和农业经济动物为研究对象，应用干细胞诱导产生的生殖细胞来培育优化动物。 3，可行性分析 本项目的总体方案是切实可行的。首先，本项目提出的主要科学问题和研究目标不仅具有理论和实际依据，而且都是该领域前沿性和关键性的问题。我们在干细胞学、胚胎发育学、生殖学等领域进行了多年的研究，取得了一些重要的成果，具备完成本项目的坚实基础。研究方案建立在申请者以及项目组成员大量的相关研究工作的基础上，实验设计合理周密。研究课题所用的方法和材料都是本项目组成员多年应用、被证明是行之有效的方法；而且，我们的课题组成员积累了大量的关键性研究材料，如各种ES细胞系，iPS细胞，转基因鼠，牛等，可为本项目的实施提供强有力的保证。其次，项目承担单位具有良好的研究条件和基础，并且已经具备了相当的规模、取得了很好的科研成果。我们拥有完善的蛋白质组学，BiFC，基因组学，信息学，干细胞学等研究平台，可以完成本项目所涉及的研究工作。中山大学及其他参与的单位拥有大型及关键性仪器设备，采用公共平台建设方式，已拥有的条件（动物房和仪器设备等）、各重点学科实验室等设备均可公用，这将为本项目提供较全面的技术条件。本项目注重各研究课题之间的配合、确保信息共享，发挥专业交叉、知识互补、团结协作的精神，确保本项目圆满、顺利完成。其三，承担本项目研究工作的中坚力量和学术骨干多数是新近从海外留学工作归国的成绩卓著的中青年科学家，拥有丰富的研究成果和研究经验，多次在国际著名专业杂志上发表论文。这些都是确保研究项目顺利实施和取得重大成果的最基本、最关键的因素。本项目课题组成员熟悉当前的研究状况和方法，对本项目的研究具有较强的掌控能力和应变能力，能够保证项目的顺利完成。 4，创新点 本项目探讨影响国计民生的的重大科学问题。项目中的四个子课题既相互独立，又交叉互补。这些课题既是有关研究人员各自多年工作的合理延伸和拓展，又集中了优势力量，对诱导干细胞向生殖细胞分化中的核心问题进行多侧面的合作研究。本题目的创新性主要体现在： (1)本项目探讨的问题是国际前沿的科学问题，因此保证了项目的创新性。本项目的选题涉及干细胞向生殖细胞分化过程中重要蛋白调控网络；雄性生殖细胞体外诱导分化的基因表达及调控机理；胚胎干细胞向原始生殖细胞分化的体系及机理；干细胞向生殖细胞诱导分化技术在农业经济动物培育上的应用等科学问题。将基础科学与实际应用相结合，力争在解答基础科学问题的同时，发展新的动物繁殖技能。 (2)本项目在充分利用课题组已建立的蛋白质组学研究平台，BiFC研究平台（松阳洲教授研究团队独创），信息学研究平台和基因组学研究平台的基础上，发展和创建综合技术平台及多种细胞和动物模型，分析从干细胞诱导生成生殖细胞过程中的蛋白调控网络和基因调控机理，填补生殖细胞发育机理和干细胞分化机制研究领域的空白，为干细胞的再生医学及畜牧产业的应用提供新的途径。 (3)本项目着眼于技术创新, 通过建立诱导干细胞生成生殖细胞的技术体系，获得功能性生殖细胞，为大型经济动物优良种群的培育提供技术支持。同时，通过建立大型经济动物胚胎干细胞，研究在体外特定条件下的分化潜能，尝试培育生长性能好、环境友好型、品质优良的新品种。这些可为人类提供高品质食源，具有非常明显的创新性。通过这些尝试，可能开辟家畜育种和保种的新途径、新方法，也可以促进干细胞在人类医疗事业上的早日应用。 5，组织方式 (1)在组织方面，以总体研究方案为中心，强调团队化、体系化。瞄准战略目标，统一思路，力求持续发展。项目规划管理和运作体制包括总项目和子课题两个层次。项目设负责人1 名（首席科学家），负责整个项目的贯通实施。首席科学家聘任若干学术专家组成项目顾问专家组，参与项目的领导、组织、运行和管理，协助项目负责人，调整和确定项目的方向及技术路线，制定有效可行的研究计划，指导协调各课题的工作，督促各课题间的交流，并审核各子课题的进展情况。顾问专家由相关学科领域成就卓著的专家组成，承担单位之外的专家占绝大多数。 (2) 在研究方面，不只停留在单项技术或研究手段上，而是发展综合技术平台及多种细胞和动物模型。为此，本项目将以系统性运作方式为主。不但充分发挥子课题各承担单位的技术和学科优势，而且加强优势力量的整合和协同攻关，发扬团队精神，形成科研功能配套、统筹合理、机动灵活且充满活力的科研体系。 6，课题间的相互关系 本项目以中山大学为主体，联合中国科学学院，华东师范大学及中国农业大学等单位，围绕总体研究目标，本项目设立4个课题组，研究过程中相互配合、优势互补，提倡资源共享。本项目的执行采用首席科学家负责制。首席科学家将充分发挥课题负责人和学术带头人的作用，采用学科交叉、分工合作的方式来实施研究计划。同时，首席科学家将在相关部门的领导下，根据国家规定，通过项目专家委员会，采用激励和滚动机制对项目进行管理。本课题设置上紧密围绕干细胞诱导生成生殖细胞这一重大科学问题，以研究诱导分化技术、蛋白调控网络、减数分裂机理以及农业经济动物培育为主线，将各个课题有机地结合起来，使各方面的研究工作既具有明确的研究目标，同时又相互紧密联系，形成我国在这一前沿领域的研究特色。本项目期望在诱导干细胞生成生殖细胞关键科学问题上取得重大突破性成果，保证按期完成项目的总体目标和五年目标。 课题2. 雄性生殖细胞体外诱导分化的基因表达及调控机理研究 课题1. 干细胞向生殖细胞分化过程中重要蛋白调控网络的解析 干细胞向生殖细胞诱导分化的调控机理及应用性研究 阐明干细胞向生殖细胞分化机理 产生功能性配子与克隆动物 建立以PGC关键调控元为中心的信号调控网络 全面了解转录因子和组蛋白修饰在PGC形成中的功能与调控机制 阐述端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向PGC诱导过程中的作用与机 理 探索诱导分化的生殖细胞的生物学功能及其对小鼠胚胎发育的影响 比较ESC和SSC DNA甲基化模式、基因表达和细胞表面蛋白成分的差 异 检索RA信号调控的靶基因,分析减数分裂的机 理 探讨在诱导牛干细胞向生殖细胞分化过程中信号调控网络 课题3. 诱导胚胎干细胞向原始生殖细胞分化的体系及机理研究 优化促进PGC形成的最佳体外培养条 件 探讨关键基因在小鼠PGC特化过程中的功能及体内转录调控模式 创建表达标志PGC特化的报告基因体 系，探讨关键信号网络的调控机 理 课题4. 干细胞向生殖细胞诱导分化技术在农业经济动物培育上的应用 建立合适的牛ESC体外培养体系 利用创建的牛ESC体系，探讨牛干细胞自我更新和分化的途径 诱导牛ESC分化为雄性生殖细胞 建立以ESC体外诱导分化为功能性生殖细胞的技术平台 课题1，干细胞向生殖细胞分化过程中重要蛋白调控网络的解析 研究目标：建立和完善高通量研究蛋白互动网络以及干细胞向生殖细胞分化的技术平台，包括蛋白质组学平台，BiFC组学平台, 基因组学平台，生物信息学平台。在此基础上，发现若干新的调控干细胞向生殖细胞分化的关键转录因子和染色质修饰因子，在整体细胞水平上初步确立干细胞向生殖细胞分化的网络系统。 研究内容： 1, 以一些PGC表达的关键调控元，如Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad为研究对象, 运用蛋白质组学及BiFC组学平台, 系统地发现直接与关键调控元相互作用的蛋白, 并依此建立以PGC关键调控元为中心的信号调控网络。 2, 以Blimp1 、Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa和DAZL等重要的PGC表达基因为模式， 从PGC或生殖母细胞调控元及与其相互作用的蛋白质组中筛选出控制这些基因表达的