5.3血红蛋白的提取及分离(1).ppt

课题课题3 3 :血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 PCRPCR反应需提供的条件反应需提供的条件 1:1:缓冲液缓冲液中进行中进行 2:DNA2:DNA模板模板 3:3:分别与两条模板链相结合的两种引物分别与两条模板链相结合的两种引物 4:4:四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 5 5：耐热的：耐热的DNADNA聚合酶聚合酶 6 6：同时通过控制温度使：同时通过控制温度使DNADNA复制在体外复制在体外反复进行反复进行 5 引物引物1 5 引物引物2 第二次复制第二次复制 第一次复制第一次复制 5 5 5 5 5 5 模板模板DNA 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环（复制）后，模板次循环（复制）后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万（万（220）倍以上。）倍以上。体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制 PCRPCR技术技术 解旋解旋 引物引物 一般用一般用DNADNA片段片段 DNADNA聚合酶聚合酶 细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 复制特点复制特点 半保留复制，边解旋边半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。复制，多起点复制。半保留复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的5 5端向端向 3 3端延端延伸伸 子链的子链的5 5端向端向 3 3端端延伸延伸 在解旋酶作用下，细胞在解旋酶作用下，细胞提供提供ATPATP，部分解开，部分解开 加热到加热到94oC,双链全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶 一小段一小段RNA 血红蛋白介绍：血红蛋白介绍：血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质，是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白是由白质，是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白是由574个氨基酸脱水缩合而成的含有四条肽链的蛋白质个氨基酸脱水缩合而成的含有四条肽链的蛋白质（两条（两条链和两条链和两条链，每一条链有一个包含一个铁链，每一条链有一个包含一个铁原子原子的环状血红素）。氧气结合在铁原子上，被血的环状血红素）。氧气结合在铁原子上，被血液运输。液运输。因含血红素血红蛋白呈红色。因含血红素血红蛋白呈红色。血红蛋白占血红蛋白占红细胞干重红细胞干重97%、总重的、总重的35%。平均每克血红蛋白。平均每克血红蛋白可结合可结合1.34ml的氧气，是血浆溶氧量的的氧气，是血浆溶氧量的70倍。一个倍。一个哺乳动物血红蛋白分子可以结合最多四个氧分子。哺乳动物血红蛋白分子可以结合最多四个氧分子。血红蛋白也参与其他气体的转运：它能携带机体的血红蛋白也参与其他气体的转运：它能携带机体的部分二氧化碳（大约部分二氧化碳（大约10%）。）。回忆：回忆：蛋白质蛋白质基本单位？合成场所？基本单位？合成场所？蛋白质的分子结蛋白质的分子结构具有多样性的直接原因？根本原因？构具有多样性的直接原因？根本原因？蛋白质的功能？蛋白质的功能？思考：思考：蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。以用来分离不同蛋白质。主要功能主要功能 实例实例 组成细胞的组成细胞的结构成分结构成分 细胞膜中的蛋白质，染色体中的蛋白质等细胞膜中的蛋白质，染色体中的蛋白质等 运输运输功能功能 细胞膜上的载体蛋白、运输氧气的血红蛋白等细胞膜上的载体蛋白、运输氧气的血红蛋白等 催化催化功能功能 胃蛋白酶、纤维素酶等胃蛋白酶、纤维素酶等 调节调节功能功能 生长激素、胰岛素等激素生长激素、胰岛素等激素 免疫免疫功能功能 B B 淋巴细胞受到抗原刺激后产生的抗体淋巴细胞受到抗原刺激后产生的抗体 一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：根据、概念：根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离分离蛋白质的方法蛋白质的方法 3 3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（），移动速），移动速度（度（），而（），而（）的蛋白）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（）移动，路程（），移动速），移动速度（度（），相对分子质量不同的蛋白质因），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小 较长较长 较慢较慢 相对分子质量较大相对分子质量较大 凝胶外部凝胶外部 较短较短 较快较快（分子筛效应）（分子筛效应）用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质大的蛋白质 ()()A A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路程较长，移动速度较快路程较长，移动速度较快 C C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路程较短，移动速度较快路程较短，移动速度较快 4 4、具体过程、具体过程 D 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个的进行过程可表示为图中哪一个 B 缓冲溶液：缓冲溶液：2 2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）对溶液的（对溶液的（）的影响，维持）的影响，维持PH PH 基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱 PHPH值值 1 1、组成：、组成：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成 如如:H2CO3/NaHCO3;CH3COONa/CH3COOH，NaH2PO4/Na2HPO4;KH2PO4/K2HPO4等等 3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制:通常由通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。种缓冲剂溶解于水中配制而成。电泳：电泳：1 1、概念：、概念：2 2、原理：、原理：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。不同蛋白质的不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小带电性质、电量、形状和大小不不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。从而实现样品中各种不同蛋白质分子速度不同。从而实现样品中各种不同蛋白质分子的分离。的分离。3.3.分类：分类：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和和聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳。胶电泳。测定（测定（）通常用通常用 SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量 使用使用SDSSDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于 A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小 C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异