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参与DNA复制有关的酶和蛋白质 现在已经知道约现在已经知道约2020多种蛋白质参与复制。多种蛋白质参与复制。（1 1）聚合酶）聚合酶 （2 2）解解 链、链、解解 旋旋 酶酶 类类 （3 3）引发酶）引发酶 （4 4）连接酶）连接酶 下表是与大肠杆菌复制有关的蛋白质。下表是与大肠杆菌复制有关的蛋白质。蛋白质名称蛋白质名称 分子量分子量103U 亚基数亚基数 功功 能能 每个菌中的每个菌中的分子数分子数 毫克蛋白质毫克蛋白质 公斤细胞（湿重）公斤细胞（湿重）SSB i蛋白蛋白 n蛋白蛋白 n 蛋白蛋白 n蛋白蛋白 dnaC dnaB 引发酶引发酶 74 80 25 75 11 29 300 60 4 4 1 1 1 1 6 1 与单链结合与单链结合 预引发预引发 预引发预引发 部位识别部位识别,ATPase 预引发预引发 预引发预引发 移动启动子移动启动子,ATPase 引发合成引发合成 300 50 30 70 -100 20 50 20 0.5 0.3 0.3 0.2 表表 与大肠杆菌复制有关的蛋白质与大肠杆菌复制有关的蛋白质 接下页接下页 BACK 蛋白质名称蛋白质名称 分子量分子量103U 亚基数亚基数 功功 能能 每个菌中的分子每个菌中的分子数数 毫克蛋白质毫克蛋白质 公斤细胞（湿重）公斤细胞（湿重）Pol 全酶全酶 140 25 10 37 52 32 83 1 1 2 1 2 1 1 链的延长链的延长 300 20 0.5 Pol 109 1 填补缺口和切去引填补缺口和切去引物物 300 10 连接酶连接酶 74 1 连接连接 300 10 拓扑异构酶拓扑异构酶 400 210 190 4 2 2 引进超螺旋引进超螺旋 _ 250 25 rep 蛋白蛋白 解链酶解链酶 dnaA 65 75 48 1 1 解开双链解开双链 复制起始复制起始 50 5000 200 0.6 Rep蛋白是一种大肠杆菌解链酶蛋白是一种大肠杆菌解链酶 1 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶的一类酶。全称：全称：DNA依赖的依赖的DNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol 活性：活性：1.53 的聚合活性的聚合活性 2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性 所有所有DNA聚合酶的作用方式基本相似。它们催化聚合酶的作用方式基本相似。它们催化脱氧核苷三磷酸加到复制中的脱氧核苷三磷酸加到复制中的DNA链的链的3羟基末羟基末端，端，合成方向从合成方向从53，由模板决定加上何种脱，由模板决定加上何种脱氧核苷酸。氧核苷酸。5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段和片段和RNA引物。引物。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目 录录 DNADNA聚合酶的分类聚合酶的分类 DNA-pol 主要的修复酶主要的修复酶 DNA-pol 次要的修复酶次要的修复酶 DNA-pol 复制酶复制酶 DNA-pol IV SOS修复修复 DNA-pol V SOS修复修复 原核生物的聚合酶原核生物的聚合酶 (1)大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I(Pol)纯的纯的DNA聚合酶聚合酶I由分子量由分子量109 000U(109KD)，含含928个氨基酸残基的个氨基酸残基的一条肽链构成一条肽链构成，每个大肠杆菌细胞中大约含每个大肠杆菌细胞中大约含400个酶分子个酶分子。(单链多肽单链多肽）功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。323个氨基酸个氨基酸 小片段（小片段（34KD）5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大片段大片段/Klenow 片段片段（76KD）604个氨基酸个氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 N 端端 C 端端 枯草杆菌蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶胰蛋白酶 DNA-pol DNA聚合酶聚合酶的的多种活性。多种活性。53聚合活性：聚合活性：在模板指导下，以脱氧核苷三磷酸为底物在引物在模板指导下，以脱氧核苷三磷酸为底物在引物3-OH末端加上脱氧核末端加上脱氧核苷酸苷酸。每个酶分子每分钟添加。每个酶分子每分钟添加1 000个单核苷酸。个单核苷酸。聚合酶催化的聚合酶催化的DNA的合成需要以下条件：的合成需要以下条件：模板模板 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 必须有一必须有一 3-OH末端的引物，且此引物必须与模板正确形成氢键末端的引物，且此引物必须与模板正确形成氢键 合成从合成从53方向进行，如图方向进行，如图7-8和图和图7-9所示所示 35外切酶活性：外切酶活性：没有脱氧核苷三磷酸底物时没有脱氧核苷三磷酸底物时，DNA聚合酶聚合酶 I 能从能从3-OH开开始以始以35方向水解方向水解DNA，产生，产生5-单核苷酸。单核苷酸。实际上实际上DNA复制时，加上去的脱氧核苷酸不一定每次都正复制时，加上去的脱氧核苷酸不一定每次都正确，错误的机会不少，有时甚至加上一个不与模板配对的核苷确，错误的机会不少，有时甚至加上一个不与模板配对的核苷酸，酸，当当3-OH末端的碱基不与模板配对时聚合酶就无聚合活性，末端的碱基不与模板配对时聚合酶就无聚合活性，此时它具有的此时它具有的35外切酶活性可以切除这个不配对的核苷酸，外切酶活性可以切除这个不配对的核苷酸，这一碱基切除后，外切核酸酶活性终止，聚合酶活性恢复，这一碱基切除后，外切核酸酶活性终止，聚合酶活性恢复，如如图图7-10所示。所以聚合酶的所示。所以聚合酶的35外切酶活性也叫外切酶活性也叫修补活性修补活性。53外切酶活性：外切酶活性：DNA聚合酶聚合酶I具有具有53外切酶活性外切酶活性。如图如图7-11，其特点是：其特点是：只能在只能在5-P末端一个接一个地切除核苷酸；末端一个接一个地切除核苷酸；能连续地切除多个核苷酸；能连续地切除多个核苷酸；只切除配对的只切除配对的5-P末端核苷酸末端核苷酸，不切除不配对的单链不切除不配对的单链5-P末端核苷酸；末端核苷酸；既能切除脱氧核苷酸也能切除核苷酸；既能切除脱氧核苷酸也能切除核苷酸；对只具有对只具有5-P末端的切口也有活性末端的切口也有活性（由于在由于在DNA复制过复制过程中一般情况下只在程中一般情况下只在RNA引物处才有缺口引物处才有缺口，因此因此53外切酶外切酶活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物）。切口翻译切口翻译(nicktranslation)DNA聚合酶聚合酶 I 的的53外切酶活性和聚合活性同时作用可外切酶活性和聚合活性同时作用可以进行切口翻译以进行切口翻译(nicktranslation)，用来，用来制造放射性探针制造放射性探针。在反应物里加入同位素标记的脱氧单核苷酸，在反应物里加入同位素标记的脱氧单核苷酸，DNA聚合酶聚合酶I 首先利用首先利用53外切酶活性，从切口处逐个切下外切酶活性，从切口处逐个切下DNA上的核苷上的核苷酸，再利用酸，再利用3-OH末端聚合作用末端聚合作用逐个将标记的核苷酸加上去逐个将标记的核苷酸加上去(图图712)。5 3 5 3 内切酶活性：内切酶活性：DNA聚合酶聚合酶 I 也具有也具有53 内切酶活性内切酶活性，如图如图7-13所示所示。在两个碱基之在两个碱基之间切开产生一个具有间切开产生一个具有5-P 末端的末端的不配对碱基的片段不配对碱基的片段。很多实验证明很多实验证明DNA聚合酶聚合酶 I 在大肠杆菌复制中不是主要的合成酶，而在大肠杆菌复制中不是主要的合成酶，而是是在除去在除去RNA引物和损伤修复中起重要作用。引物和损伤修复中起重要作用。不配对的片段不配对的片段 内切酶活性内切酶活性 （2）大肠杆菌大肠杆菌 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶缺陷的突变株仍能生存缺陷的突变株仍能生存，这表明这表明DNApol不是不是DNA复制的主要聚合酶复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的人们开始寻找另外的DNA聚合酶聚合酶，并于并于1970年发现了年发现了DNApol。从从53方向合成方向合成DNA 具有具有35外切酶活性外切酶活性，但没有但没有53外切酶活性外切酶活性。在体外的合成速率比体内的速率要低得多，带有这个酶缺陷在体外的合成速率比体内的速率要低得多，带有这个酶缺陷的大肠杆菌突变株染色体的复制各方面都正常，它在体内的功能的大肠杆菌突变株染色体的复制各方面都正常，它在体内的功能可能和可能和DNA聚合酶聚合酶 I 类似。类似。(3)大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 聚合酶聚合酶是体内是体内DNA复制所必需的酶复制所必需的酶 带有带有DNA聚合酶聚合酶 的温度敏感突变的温度敏感突变(polc)的大肠杆菌在限制温度的大肠杆菌在限制温度下是不能存活的下是不能存活的，从这种菌株得到的裂解液也不能合成从这种菌株得到的裂解液也不能合成DNA，当加入正当加入正常细菌的常细菌的DNA 聚合酶聚合酶 时可以恢复它的聚合能力时可以恢复它的聚合能力，因此不同于因此不同于DNA聚聚合酶合酶I和和，聚合酶聚合酶是体内是体内DNA复制所必需的酶复制所必需的酶。DNA多聚酶多聚酶相当复杂相当复杂，其结构和各亚基的功能如图其结构和各亚基的功能如图1124，25所示所示。DNA pol 具有具有53聚合功能聚合功能。催化核心(165KD)合成 DNA 当夹子装到 DNA 上时夹子装配器水解ATP 25 KD 130 KD 10 KD Pol*(470KD)增加进行性 71KD 夹子装配器 A TPADP+P 夹子 DNA Pol(750K)使 复合体结合模板 核心酶 32KD 52 KD 52KD 2 核心酶产生不对称的二聚体 全酶合成前导链和后滞链 前导链的合成 后滞链的合成 52KD 52KD 亚基维持二聚体 图 11-24 DNA 聚合酶的组成及各部分的功能 图 11-25 DNA 聚合酶 全每的装配过程 DNA聚合酶聚合酶 的的“核心酶”“核心酶”由由、三种亚基组成。三种亚基组成。亚基具有合成亚基具有合成DNA的能力。的能力。亚基具有亚基具有35外切酶的功能，起到外切酶的功能，起到校正的作用。校正的作用。亚基可能在组装中发挥功能。亚基可能在组装中发挥功能。亚基加到核心酶上使其二聚化，亚基加到核心酶上使其二聚化，进一步产生进一步产生pol III。复合体加入到复合体加入到pol，进一，进一步形成步形成 pol 复合体。复合体。复合体是由复合体是由，和和亚基组成，其作用是固定亚基组成，其作用是固定亚基这个“夹子”的支架。亚基这个“夹子”的支架。亚基亚基：形成夹钳，保持催化形成夹钳，保持催化核心和模板链的结合核心和模板链的结合 聚合酶聚合酶的活性的活性 聚合活性：聚合活性：DNA复制时聚合酶复制时聚合酶 全酶十分重要全酶十分重要，它可以它可以在在DNA模板上的引物的模板上的引物的3-OH上以每分钟约上以每分钟约50 000核苷酸的速核苷酸的速率逐个延伸新生的率逐个延伸新生的DNA。35和和53的外切酶活性：的外切酶活性：pol 的的53外切酶活性与外切酶活性与pol的不同的不同，pol 的的53外切酶活性只对外切酶活性只对 单链单链 DNA有作用有作用，因此不能用于缺口翻译因此不能用于缺口翻译。DNA聚合酶聚合酶的作用范围如图的作用范围如图7-14所示所示。催化催化DNA聚合聚合 参与参与DNA损损伤的应急状伤的应急状态修复态修复 修复合成、修复合成、切除引物、切除引物、填补空隙填补空隙 功能功能 20 40 400 分子数分子数/细胞细胞 10 1 1 亚基数亚基数+-+5 外切酶活性外切酶活性+5 外切酶活性外切酶活性+5