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动物病毒性疾病分子流行病学动物病毒性疾病分子流行病学研究方法研究方法 江西农业大学动物科技学院江西农业大学动物科技学院 何后军何后军 教授教授 联系电话：联系电话：0791-3813149 E-mail: 分子流行病学分子流行病学 1972年Kilbourne 博士在美国传染病学会第10次年会上作了题为“流感的分子流行病学”的报告。1977年法国Higginson认为“分子流行病学”是应用复杂精细的技术进行生物材料的流行病学研究。1982年Perera与Weinstein在分子流行病学基础上,提出了“癌症分子流行病学”(molecular cancer epidemiology)一一 产生的背景产生的背景 (一一)疾病预防控制中的需求疾病预防控制中的需求 传染性疾病传染性疾病 耐药性质粒；病原体变异；新发现传染病。慢性非传染病慢性非传染病 多病因、多阶段、多基因、长潜隐期。人群易感性人群易感性 生物个体间的遗传和环境不同，易感性差异很大；传统流行病学无法有效测量。实验医学实验医学 实验医学的病因假设和防治措施的人群检验。一一 产生的背景产生的背景 (二二)分子生物学的快速发展分子生物学的快速发展 理论的突破理论的突破 如：DNA双螺旋结构，遗传中心法则，遗传密码子，RNA逆转录，断裂基因，操纵子模型，限制性内切酶，DNA聚合酶，DNA连结酶，染色体外遗传物质等。技术的创新技术的创新 凝胶电泳技术，核酸体外扩增，DNA测序，蛋白质测序，分子杂交，基因克隆，色谱技术，计算机应用。定义定义 分子流行病学分子流行病学(molecular epidemiology)(molecular epidemiology)是应用先进的技术测量生物标志生物标志的分布情况，结合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并研究疾病的防治和促进健康的策略和措施的科学。生物标志生物标志（biological marker，biomarker，简称M）指能代表生物结构和功能的可识别物质。分子事件（molecular event）或分子生物标志（molecular biomarker）主要指代表生物结构和功能的生物大分子特征。如DNA、RNA、蛋白质等。现代流行病学遇到的难题现代流行病学遇到的难题（1）传染病方面：病原生物的多样性和多变性，如流感病毒、艾滋病毒；抗生素广泛应用，耐药性病原体不断出现；新发现的传染病，SAS等 传统表型研究 从分子或基因水平阐明 （2）研究个体的发病差异 根本阐明个体差异必须从分子水平研究 （3）证实疾病的病因 (三三)分子流行病学的发展分子流行病学的发展 研究内容更加丰富研究内容更加丰富 传染病、慢性非传染病、健康状态。研究手段越来越多研究手段越来越多 主要是分子生物学方法和技术。应用范围不断扩大应用范围不断扩大 流行病学、预防医学、基础医学、生物学、遗传学、环境科学和人类学等。研究的水平不同：研究的水平不同：传统流行病学：宏观水平或表型 分子流行病学：微观水平或基因水平 所解决的问题不同：所解决的问题不同：传统流行病学：可阐明暴露与发病之间的联系，但不能揭示疾病发生的机制（黑匣子）。分子流行病学：既可阐明暴露与疾病之间的联系，又可揭示疾病发生的机制。即可以阐明疾病的自然史。二、与传统流行病学的关系二、与传统流行病学的关系 暴露暴露-暴露(E)与剂量(ED)结局结局-健康态(HC)机体临床态(CD)(健康疾病连续带)传统流行病学传统流行病学 分子流行病学 暴露生物标志暴露生物标志-外暴露标志(EEM)与剂量(EED)内暴露标志(IEM)与剂量(IED)生物作用标志(BAM)与剂量(BAD)健康疾病连续带健康疾病连续带：健康态亚健康态潜在疾病态临界疾病态亚临床态临床态 效应生物标志效应生物标志：HCM EBEM ASFM PM SCCM CDM 易感生物标志易感生物标志-易感标志与水平(SM&SL)三、与分子生物学的关系 研究对象不同:分子生物学：个体 分子流行病学：群体 研究内容和方向有所不同:分子生物学：基础研究（方法学研究）分子流行病学：应用研究（指导疾病治）分子流行病学的特点分子流行病学的特点 与传统流行病学的区别 1.研究水平不同 宏观水平 微观水平 2.所解决问题不同 揭示“黑匣子”之谜 与分子生物学的区别 1.研究对象不同 个体 群体 2.研究内容和方向有所不同 侧重基础，侧重应用 分子流行病学的主要分子流行病学的主要研究内容研究内容 传染病病因及流行规律的探讨 非传染病病因及病因致病机制研究 疾病易感性的测定 疾病防治措施的研究 疾病治疗效果和预后评价 生物标志（测量指标）的研究 暴露测量及其与疾病的关系 效应测量及其与疾病的关系 易感性测量及其与疾病的关系 疾病防治效果评价 传染病病因及流行规律的探讨传染病病因及流行规律的探讨 对已知传染病，通过分子流行病学研究可阐明病原体特点，能更准确地分析其传染源和传播途径；对新发现的传染病，可以尽快确定传染病的病因和流行规律。1、研究已知传染病的病原体和流行特点 基因水平研究病原体 快速准确阐明 其特点分析病因、传染源和传播途径 利于防治 流行或爆发时 病原体的鉴定和分型十分重要 传统：从表型进行鉴定、分型 不稳定或无法进行分型 现在：从分子或基因水平鉴定、分型 直接反映其遗传本质、特点 稳定可靠 2、研究新发传染病病原体和流行特点 新发传染病 分子流行病学研究方法 查找病原体，确定遗传特点 阐明病因、传播规律和流行特点 如庚肝的发现和心肌V.分离 非传染病病因及病因致病机制研究 病因复杂 环境因素+遗传因素 通过分子流行病学的研究方法可阐明疾病发生的遗传本质、环境因素致病的分子基础，为疾病的防治提供理论依据。二、疾病易感性的测定 个体对疾病都存在一定的感受性，称之易感性 以往认为：只有传染病才有确定易感性 特异Ab 传染性疾病的易感性与机体某些基因类型有联系，决定免疫反应的方式与强度 慢性病也存在易感性，与个体基因型别或序列或其表达产物有关 遗传易感性 三、疾病防治措施的研究 传染病的预防 通过分子流行病学手段，可以研究疫苗的预防效果、疫苗株引起的感染以及疫苗的逃逸株等问题。非传染病的防治 分子流行病学通过研究病因的致病机制，为三级预防奠定理论基础。以肿瘤为例以肿瘤为例 四、疾病治疗效果和预后评价 从分子或基因水平评价治疗措施的效果及判断预后，更客观、快速、准确、节约 对基因治疗，可能是唯一可行的评价方法。通过检测患者体内是否有导入的基因及导入的基因表达情况，判断治疗效果。生物标志与分子生物学标志 生物标志(biological markers，biomarkers)是宿主生物材料(组织、体液、细胞)中可测量的细胞的、生物化学的、免疫的或分子的改变。是可以测量的、能代表生物结构和功能的大分子物质，如DNA、RNA或蛋白质等。分子生物学标志(molecular biomarkers)能反映分子水平、基因水平的DNA损伤、变异和表达的蛋白质分子的生物标志。生物标志的分类 在暴露-疾病链中，一般可将生物学标志分为:体内剂量标志、生物有效剂量标志、生物学反应标志、疾病标志，此外，尚有易感性标志：起着重要作用,是决定疾病能否发生的主要因素。常用按疾病发病过程进行分类，根据疾病发生的不同阶段出现不同的标志,分为三类：暴露标志、易感性标志和效应或疾病标志 五、生物标志五、生物标志 暴露标志暴露标志(exposure marker)与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。效应标志效应标志 指宿主暴露后产生功能性或结构性变化的生物标志，如突变的基因、畸变的染色体等。易感标志易感标志 指宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志。外暴露标志：外暴露标志：是指暴露因素进入机体之前进入机体之前的标志和剂量 生物性：微生物、寄生虫、生物毒素等;非生物性：某些化学和物理因素，如吸烟烟雾、环境物质等。内暴露标志：内暴露标志：指暴露因素进入机体之后进入机体之后的标志 生物性病原因子生物性病原因子：可以是生物病原因子本身、其代谢产物或与宿主体内生物大分子结合产物，像病毒整合基因、生物毒素-DNA加合物等 非生物性病原因子非生物性病原因子：可以是体内转运分子、代谢产物或与宿主靶体结合物等，如暴露于苯并(a)芘后，在淋巴细胞中能检测到特异的DNA加合物。易感性标志(susceptibility marker)易感性标志：易感性标志：指宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志，如宿主的遗传特征、营养、免疫、机体的活动状态等。是在暴露之前就已存在的遗传性或获得性的可测量指标，决定着机体对疾病发生、发展的易感程度。可以探讨疾病发生的个体差异。效应标志(effect marker)或 疾病标志(disease marker)宿主暴露于某种因素后产生结构或功能性变化的生物性标志，如突变的基因、畸变的染色体、特异抗体、细胞因子等。在病后的不同阶段，其效应标志不同 生物标志的筛选 要求：具有较好的特异性和稳定性 检测方法具有较高的灵敏度，特异度高 检测方法快速、简便 依据：研究目的、生物学标志的本身特性、在疾病过程中的意义、检测方法、生物学标志与所要代表的特定阶段的关联程度。生物标志特性生物标志特性 分子特性分子特性 化学结构、组成、物理特性和稳定性等 时相特性时相特性 即生物学标志存在的时间长短及其在暴露至疾病不同阶段的表现和意义。变异性变异性 -个体内变异个体内变异 生物标本采集时间、部位等不同造成 -个体间变异个体间变异 不同生物个体的检测结果不相同 -群体间变异群体间变异 不同生物群体的检测结果不相同 -储存变异储存变异 生物标志的生物特性、储存条件、储存时 间等都会影响其检测结果 生物标志检测方法生物标志检测方法 实用性实用性 研究样本一般较大 一定的实验室条件 可信性可信性 可信性强 有效性有效性 灵敏度和特异度，注意区分流行病学的灵敏度和实验室测量中所谓的敏感性的不同 暴露测量暴露测量 外暴露研究外暴露研究 指环境因素暴露，分为生物性因素和非生物性因素。作为分子流行病学测量的生物标志一般是生物性病原因子，如病原生物、生物毒素等。生物性病原因子检测鉴定生物性病原因子检测鉴定 流感嗜血杆菌 病原生物进化变异规律研究病原生物进化变异规律研究 O157大肠杆菌 确定传播途径确定传播途径 S.munchen菌感染 非生物性因素的暴露测量非生物性因素的暴露测量 吸烟烟雾 可研究病原生物分型、分类和检定是最有效手段、研究病原生物变异的规律等。这是传染病分子流行病学的重要使命。内暴露研究内暴露研究 传染性疾病传染性疾病 应用分子生物学方法直接检测病原体的生物大分子物质如核酸、蛋白质等，使我们能够准确地判断人体是否感染疾病，即感染状感染状况况；用分子生物学技术鉴定各感染者所感染病原体之间的遗传关系，可追踪传染源追踪传染源 慢性非传染性疾病慢性非传染性疾病 内暴露水平 生物作用水平 效应测量效应测量 传染病传染病 免疫效应：测定体内抗体变化可以判断机体感染状态。病理性效应：测量机体损害性的生物标志可以判断病原生物感染的病理效应。慢性非传染病慢性非传染病 基因表达异常和代谢异常 基因突变或染色体畸变 健康状态：健康状态：一个群体从疾病到健康或从健康到疾病也是一个连续带。通一个群体从疾病到健康或从健康到疾病也是一个连续带。通过健康状态相关生物标志分布的研究，如生长、发育和衰老，可以为过健康状态相关生物标志分布的研究，如生长、发育和衰老，可以为探讨影响健康的因素、制订促进健康的策略和措施提供科学依据。探讨影响健康的因素、制订促进健康的策略和措施提供科学依据。易感性测量易感性测量 探明遗传病易感(致病)基因、分布规律、影响因素和防制手段，传染病和寄生虫病的易感性水平高低可以从两个方面评判，一是特异抗体水平，二是对该病原体致病的遗传易感性。第二方面则是分子流行病学研究的重要内容之一。疾病防治效果评价疾病防治效果评价 预防评价：分子生物学技术可用于传染病的预防效果评价中